Microbiologie: virologie
Deel 1: Inleiding en diagnostiek
• Virologie: ziekmakende virussen belangrijk voor ons → niet alle virussen gevaarlijk
• Endogene retrovirussen in genetisch materiaal (groot deel erfelijk materiaal)
→ Bepalen wie we zijn
• Ziekte makende virussen hebben niet de bedoeling om ons ziek te maken → erfelijk
materiaal vermenigvuldigen
→ Als gastheer sterft = eindstadium voor het virus = ramp
→ Ziek worden is overreactie van ons lichaam!
• ‘Virus’ = vergif, een nieuwe entiteit die duidelijk geen bacterie is
• Vanaf midden 20e eeuw meer virologie
• Via heleboel paden naar virologie raken:
• Historisch enkele belangrijke virussen:
→ vb. pokken (nu uitgeroeid door
vaccinatie)
→ Polio (bezig uitgeroeid te worden):
spieren verlammen, in ijzeren long bij
middenrifverlamming (beademen door
onder en bovendruk)
→ Nog maar 2 landen waar het voorkomt (Afghanistan en Pakistan) want moeilijke
vaccinatie daar
→ Gaat verkeerde richting uit: laatste polio moeilijk te controleren!
→ AIDS: belangrijkste doodoorzaak bij mannen in VS op een bepaald moment (’80-’94)
Virale structuur
• Grootte: zeer klein (25-400 nm)
→ Elektronenmicroscoop (niet te zien op gewone)
→ Ultrafiltreerbaar (filters die bacteriën tegenhouden laten deze door)
• Oranje bacterie: E. Coli (1500 nm)
• Mimivirus : grootste virus (400 nm)
• Pokkenvirus (300 nm)
• Herpesvirus (100 nm)
• Picornavirus (25 nm)
• Nobelprijs gegeven voor elektronenmicroscoop + foto van het
tabaksmosaikvirus
• Nu kunnen we kristallen maken van virussen, X ray om modellen
te maken
• Structuur ontdekt door Rosalind E Franklin
• Nu met cryo-elektronmicroscoop: elk atoom kunnen zien
,Envelope/naakt
Lipide dubbellaag envelope
• Deel vd celwand waaruit het virus geboren is (bij mensen dus
menselijk materiaal)
• Vloeibaar vetlaagje rond een virus met viruseigen eiwitten erdoor
(zo receptor vinden)
• Maakt het niet beter beschermd → net niet, zonder deze laag, is
het virus onschadelijk
→ Niet voordelig, maar zo makkelijker menselijke cellen binnen
Capside
= eiwitmantel
Kan 3 vormen aannemen: helicaal, icosahedraal en compex (geen van deze 2)
Helicaal
• Streng RNA moet beschermd worden → dakpansgewijs hetzelfde capside-eiwit
• Vormt spontaal dit capside, geen extra energie voor nodig
• Vb. Tabaksmozaiekvirus, ebolavirus (flexibeler)
Icosahedraal
• Veel voorkomend, stevig (kan veel weerstand weerstaan)
• Gemaakt uit allemaal caspomeren
• 6-hoekige structuur, soms ook 5-hoekige
• Vb. Adenovirus, herpesvirus, papillomavirus
Complex
• Alles wat geen van beide is
• Vb. pokkenvirus, of een T-bacteriofaag (niet echt kennen)
Genoom
• DNA/RNA
• Dubbelstrengig/enkelstrengig
• Lineair/circulair
• 1 stuk/segmentair
DNA genoomstructuur
• dsDNA: klassiek, zoals herpesvirus
• ssDNA: vb parvovirus (is een uitzondering in menselijke cellen)
→ Kinderziekte, bij volwassene iets erger (moeilijkere RBC aanmaak)
→ Normaal recupereren na 14 dagen, bij zwangerschap meer problemen: RBC ontwikkeling
helemaal stilgelegd → onontdekt foetus sterven
→ Om de paar jaar een epidemie: als foetus dan niet meer beweegt snel kijken voor infectie
en intra-uteriene bloedtransfusie!
RNA genoomstructuur
• dsRNA: vb rotavirus, niet veel dsRNA
• ssRNA: meest voorkomend, vb mazelenvirus
,Circulaire genoomstructuur
• Circulair dsDNA: vb papillomavirus
• Circulair ssRNA: lijkt ds maar is circulair (deels ds), vb plant viroiden (want
geen eiwitmantel)
Hepatitis B virus
= speciaal virus, is in de cel zelf dubbelstrengig
en circulair
→ In partikel zelf 2/3 dubbel en 1/3
enkelstrengig
Segmentaire genoomstructuur
• Vb rotavirus: 11 segmenten
• Vb griepvirus: 8 RNA segmenten
• Vb hantavirus: 3 segmenten
→ Voordeel om met andere virussen van dezelfde soort materiaal uit te wisselen → virus kan
heel snel evolueren
→ Hantavirussen enkel in de bossen in de Kempen, door uitwerpselen van muizen
→ Acuut nierfalen, maar recuperatie = niet dood meestal
• Laten dus toe om deeltjes uit te wisselen = reassortering
→ Bij een pandemie vaak een virus dat op een of andere manier
gereassorteerd is
Tabel:
Virus taxonomie
• Naamgeving door het ICTV = International Committee on Taxonomy of Viruses
Virale replicatie
• Doel van een virus: repliceren
→ Hebben een gastheercel nodig om aan replicatie te doen (gijzelen een cel voor eigen
doeleinden)
,Virale replicatiecyclus
Binding aan cellulaire receptor
• Sleutelslotmechanisme: eerst vasthangen dan pas opname
→ Niet zo eenvoudig: meerdere receptoren spelen een rol
• Receptor zit niet op een cel om virus binnen te laten → heeft een
andere functie
Binnendringen in doelwitcel
Fusie van geënveloppeerd virus met plasmamembraan
• Virus komt naakt in de cel,
vrij eenvoudig
• Soms zo binnen door
gewoon op de celwand te liggen
(cel is nieuwsgierig en laat binnen)
Endocytose van een niet-geënveloppeerd virus
• Eens in de cel een
geënveloppeerd virus, kan
fusioneren met
plasmamembranen in de cel
(Golgi)
Endocytose van een geënveloppeerd virus
• Dan krijg je een dubbellaag
• Gaat met een lysosoom versmelten
→ pH zakt en envelope fusioneert met
endocytoplasmatisch vesikel
→ Zo een naakt virus in het cytoplasma
Injecteren van viraal genoom in doelwitcel
= bacteriofagen
Ontmanteling van het virus
• Meestal spontaan (in uren of dagen)
,Synthese ‘vroege’ eiwitten – viraal DNA/RNA replicatie – synthese ‘late’ eiwitten
• Gijzelingsproces = het overnemen van de cel voor eigen doeleinden
• Vroege eiwitten: eiwitten nodig om verdere replicatie te doen
• Late eiwitten: capside-eiwitten
•
Assemblage nieuwe virions
• Gaan opstapelen in de cel
→ Als envelope nodig: tegen de celwand
gaan liggen (anders gewoon in cel)
Vrijzetting nieuwe virions
• Celvriendelijke manier: budding
→ Voor virussen die langer aanwezig zijn
→ Envelope w gemaakt
→ Gaat trager
→ Cel wordt als maar krapper en zonder voldoende
celwandsynthese (want teveel energie nodig) sterft de
cel toch
• Niet-celvriendelijke manier: cel opblazen
→ Vaak acute symptomen, plots duizenden virions
Diagnositiek
• Rechtstreeks: aantonen van een virus → liefst dit, maar niet altijd mogelijk
• Onrechtstreeks: aantonen van antistoffen → tragere manier, duurt 10-14d voor aanwezig pas
Rechtstreeks: aantonen van een virus
Elektronenmicroscopie
• Duur en bewerkelijk → maar als foto vaak ook diagnose (of denkrichting)
• Veel info uit dat eerste beeld
• Niet simpel, is specialistenwerk
• Drager = een klein gridje
→ Oppervlaktespanning houdt vloeistof vast → visualisatie
→ Randjes van het gridje amper zichbaar door de grote vergroting
→ Kleuren met een speciale (kleurloze) vloeistof: osmiumtetroxide
• Heel duur toestel nodig: meestal in het donker
Immuno-elektonenmicroscoop
• Sommige virussen komen niet veel voor in een staal → gridjes behandelen met antilichamen
tegen hetgeen je naar op zoek bent (enkel als je goed idee hebt wat het zou zijn)
→ Virussen gaan klonteren en zijn makkelijker te vinden
Virale kweek op celcultuur
• Was heel belangrijk, nu minder
• Nu: groeien heel goed op eieren, dienen als soort biofabrieken om virus te vermenigvuldigen
→ Wordt nog veel gebruikt voor influenza virus
• Celcultuur op individuele cellen gebeurt ook nog veel
, → Vroeger apenniercellen gebruikt hiervoor (african green monkey kidney cells)
→ Trypsine bijdoet dat de virussen uit het celverband haalt, dan op ijs mee werken → zo
individuele cellen isoleren en beginnen kweken
• Celcultuur incubatie:
• Na 7d = confluente laag cellen
→ splitsen
• Trypsinisatie:
• Contact inhibitie: als ze voelen dat er al een andere cel zit gaan ze stoppen met delen →
vormen maar 1 laag
→ Kankercellen hebben geen contactinhibitie: blijven oneindig groeien in goeie
omstandigheden
Drie soorten cellijnen
• Primaire cellijn: monkey kidney cellen
→ Kunnen maar 1-2 keer splitsen, dan dood (steeds nieuwe voorraad nodig)
• Semi-continue cellijn: human embryonic kidney, fibroblasten
→ Kunnen 50 keer splitsen: als je vroege passages invriest kun je jaren verder (uiteindelijk
wel nieuwe cellijn nodig)
• Continue cellijn: HeLa (Henrietta Lacks), Vero, Hep2
→ Kunnen een oneindig aantal keer splitsen
→ HeLa: vrouw die stierf aan baarmoederhalskanker, in elk labo gebruikt overal ter wereld
• Cellen kweken in een broedstof op 37°, in celcultuur medium bij neutrale pH
→ Nutriënten in het medium: suikers, groeifactoren
→ Optimum voor menselijke cellen (niet rhinovirussen → 28-30° in de neus)
• Kleur/pH indicator: normaal oranje
→ Als geel: teveel afvalstoffen, teveel cellen of een bacterie
→ Als roze: te weinig CO2, wordt alkalisch
Werkbanken: verschillende soorten
• Horizontale laminar flow clean air werkbank:
→Kan wel voor bacterieplaten die je steriel moet gieten (geen
bacteriën van buiten naar binnen)
→ Geen goed idee om hierin met virussen te werken!
,• Klasse I microbiologische veiligheidswerkbank:
→ Heeft een HEPA filter, zuigt lucht aan vanuit omgeving
→ Niet ideaal voor materiaal dat je steriel wil houden
→ Onderzoeker wel veilig, lucht niet naar jouw kant
→ Niet werken met gevaarlijke virussen
• Klasse II microbiologische veiligheidswerkbank:
→ Verticaal luchtgordijn die kast afsluit + HEPA filter die lucht wegzuigt
→ Perfect voor steriele, matig gevaarlijke virussen
→ Slechts beperkt deel voor handen, als je in gaat creër je turbulentie in
gordijn = gevaarlijk
• Klasse III microbiologische veiligheidswerkbank:
→ Met ingewerkte handschoenen, niet zo handig
→ Glovebox (lovebox pun, deel vd tekst was afgevallen)
→ Veilig, met 2 HEPA filters, alles erin blijft steriel = voor gevaarlijke virussen
Cytopathogeen effect
• Plaque (cellysis): het effect zien van dode cellen door het virus
→ Virus w overgedragen en later is die eerste cel dood
→ Op den duur leegte waar dode cellen zaten
! Virustitratie op celcultuur!
→ Verdunningen maken: stalen met veel en weinig virus bepalen
• Kerninclusies: grote donkere massa’s in sommige kernen
→ Opstapeling van bepaalde intranucleaire virussen
• Cytoplasma inclusies: inclusies in het cytoplasma
→ Massa in het cytoplasma duwt kern in = geen ronde kern meer
• Reuscellen/syncytia
→ Soort van cytofagocytose waar een cel een andere cel
(met virussen) gaat opnemen
→ Uiteindelijk krijg je een conglomeraat (vb mazelen of
CMV)
,• Cave: artefacten!
→ Cellen die nog niet confluent zijn
→ Zijn gewoon mitoses
→ Cel die delen kleurstof heeft opgenomen (bij teveel toevoeging
van kleurstof)
Niet-CPE methoden
• Niet elk virus heeft een CPE effect
• Hemadsorptie: sommige cellen brengen hemaglutinines aan
oppervlak
→ Deze binden RBC en zo wordt de cel gemerkt
• Immunofluorescentie: ook met antilichamen (gaan groen
kleuren)
→ Kan je doen als je al een idee hebt welk virus het zou kunnen zijn
Antigeendetectie
Immunofluorescentie
• Net hetzelfde, maar je zoekt hier naar specifieke virussen
Immunochromatografie
• Werkt zoals zwangerschapstesten
→ Je zoekt met gelabelde antilichamen naar antigenen in een preparaat
Hemagglutinatie
• Enkel bij virussen met hemagglutinine op het oppervlak
→ Als de RBC dan als een soort netwerkt verbonden zijn → soort tapijtje op de onderkant
van proefbuis (anders gewoon een puntje)
ELISA
Genoomdetectie
• Meer en meer belangrijk geworden = moleculaire diagnostiek voor genetisch materiaal van
virussen aan te tonen
In situ hybridisatie
• Met radioactive labels gaat het radioactief materiaal binden aan het virus
→ Zien op een coupe waar ze zitten
Kwalitatieve testen
• PCR (momenteel heel kleine toestellen zeggen of het aanwezig is of niet het virus)
Kwantitatieve testen
• Hoeveel er is, totaal niet van belang als je geen behandeling hebt
,Genotypering
• Weten vb welk coronavirus etc via sequentiebepaling, zeer moeilijk
• Nu een fluitje van een cent, machine niet groter dan een USB stick
• Veel gedaan tijdens corona: om te weten welk subtype het was
→ Zo ook filogenetisch onderzoek doen: stambomen maken (gebaseerd op
nucleotidesequenties)
Onrechtstreeks: aantonen van antistoffen
• Je toont de reactie van het immuunsysteem
Immunofluorescentie
→ Je kan ook al met de secundaire die gaan opsporen
Hemagglutinatie inhibitie
→ Ze gaan al binden op de virussen, RBC kunnen
niet binden
→ Zo kom je tot een titer
Complementfixatie
ELISA
Seroneutralisatie
• Cellen die een monolayer vormen met een medium erboven, virussen doden de cellen en er
zit niets meer op de bodem
• Als toevoeging van antilichamen: geen infectie, cellen blijven leven op het oppervlak
, Deel 2: Influenza en COVID-19
• Influenza = duidelijk anders dan een verkoudheid
→ Eerste paar dagen niets doen, geen eetlust, in donker willen zijn → beter na een paar
dagen
• Overgedragen als druppeltjes infectie via bio-aerosolen, altijd van iemand anders griep
krijgen
• Vermijden: handen wassen (geen enorme hulp…), 1.5m afstand
→ Deel vd overdracht via handen (handen naar ogen, 1/10 met handen aan hoofd)
→ Na 1.5m druppeltjes onder mond gezakt, maar enkel in theorie (in binnenruimte veel
verder, afh van luchtcirculatie, ventilatie…)
• Kinderen zijn vectoren ve griepepidemie: van kinderen naar ouders, ouders mee naar het
werk, van werk naar niet werkende bevolking → ouderen vaak in de 2e helft van de epidimie
• Voorbeeld op de ‘Diamond Princess’: zelf bij quarantine ging de epidemie verder →
verplaatsing via slechte ventilatie
→ Ook uit experimenten met restaurant:
→ Mensen in rood werden ziek, zaten parallel
met man bij de airco
→ Ventilatie is belangrijk: raam open zetten,
continue verdunning van viruspartikeltjes
→ Een proxy: CO2 gehalte, in normale
omgeving 450-500, hoe hoger hoe meer
recyclage van uitgeademde lucht en dus ook de
viruspartikels
Influenza di freddo
• Influenza = invloed; di freddo = van de koude (want komt vooral voor in de winter)
• Kwam eerste keer in een document in 1743 voor, spreekt over een pandemie
→ Zinloze naam want betekent gewoon invloed?
→ Ofwel gaat iedereen dood ofwel gaat het over
→ Quarantaine = 40d stilstand van mensen en goederen (enige dat men destijds kon doen
• In Parijs: grippings (daarvan ons woord griep)
→ Gripper = grijpen, het gebeurt plots, het overvalt je (’s morgens dik ok, ’s avonds plots
slecht) → bij verkoudheid is het beginpunt veel minder duidelijk
Morfologie
• Heeft een evelope, met aantal eiwitten:
→ Hemagglutinin: het H eiwit, nodig om aan een cel
te kunnen hangen
Deel 1: Inleiding en diagnostiek
• Virologie: ziekmakende virussen belangrijk voor ons → niet alle virussen gevaarlijk
• Endogene retrovirussen in genetisch materiaal (groot deel erfelijk materiaal)
→ Bepalen wie we zijn
• Ziekte makende virussen hebben niet de bedoeling om ons ziek te maken → erfelijk
materiaal vermenigvuldigen
→ Als gastheer sterft = eindstadium voor het virus = ramp
→ Ziek worden is overreactie van ons lichaam!
• ‘Virus’ = vergif, een nieuwe entiteit die duidelijk geen bacterie is
• Vanaf midden 20e eeuw meer virologie
• Via heleboel paden naar virologie raken:
• Historisch enkele belangrijke virussen:
→ vb. pokken (nu uitgeroeid door
vaccinatie)
→ Polio (bezig uitgeroeid te worden):
spieren verlammen, in ijzeren long bij
middenrifverlamming (beademen door
onder en bovendruk)
→ Nog maar 2 landen waar het voorkomt (Afghanistan en Pakistan) want moeilijke
vaccinatie daar
→ Gaat verkeerde richting uit: laatste polio moeilijk te controleren!
→ AIDS: belangrijkste doodoorzaak bij mannen in VS op een bepaald moment (’80-’94)
Virale structuur
• Grootte: zeer klein (25-400 nm)
→ Elektronenmicroscoop (niet te zien op gewone)
→ Ultrafiltreerbaar (filters die bacteriën tegenhouden laten deze door)
• Oranje bacterie: E. Coli (1500 nm)
• Mimivirus : grootste virus (400 nm)
• Pokkenvirus (300 nm)
• Herpesvirus (100 nm)
• Picornavirus (25 nm)
• Nobelprijs gegeven voor elektronenmicroscoop + foto van het
tabaksmosaikvirus
• Nu kunnen we kristallen maken van virussen, X ray om modellen
te maken
• Structuur ontdekt door Rosalind E Franklin
• Nu met cryo-elektronmicroscoop: elk atoom kunnen zien
,Envelope/naakt
Lipide dubbellaag envelope
• Deel vd celwand waaruit het virus geboren is (bij mensen dus
menselijk materiaal)
• Vloeibaar vetlaagje rond een virus met viruseigen eiwitten erdoor
(zo receptor vinden)
• Maakt het niet beter beschermd → net niet, zonder deze laag, is
het virus onschadelijk
→ Niet voordelig, maar zo makkelijker menselijke cellen binnen
Capside
= eiwitmantel
Kan 3 vormen aannemen: helicaal, icosahedraal en compex (geen van deze 2)
Helicaal
• Streng RNA moet beschermd worden → dakpansgewijs hetzelfde capside-eiwit
• Vormt spontaal dit capside, geen extra energie voor nodig
• Vb. Tabaksmozaiekvirus, ebolavirus (flexibeler)
Icosahedraal
• Veel voorkomend, stevig (kan veel weerstand weerstaan)
• Gemaakt uit allemaal caspomeren
• 6-hoekige structuur, soms ook 5-hoekige
• Vb. Adenovirus, herpesvirus, papillomavirus
Complex
• Alles wat geen van beide is
• Vb. pokkenvirus, of een T-bacteriofaag (niet echt kennen)
Genoom
• DNA/RNA
• Dubbelstrengig/enkelstrengig
• Lineair/circulair
• 1 stuk/segmentair
DNA genoomstructuur
• dsDNA: klassiek, zoals herpesvirus
• ssDNA: vb parvovirus (is een uitzondering in menselijke cellen)
→ Kinderziekte, bij volwassene iets erger (moeilijkere RBC aanmaak)
→ Normaal recupereren na 14 dagen, bij zwangerschap meer problemen: RBC ontwikkeling
helemaal stilgelegd → onontdekt foetus sterven
→ Om de paar jaar een epidemie: als foetus dan niet meer beweegt snel kijken voor infectie
en intra-uteriene bloedtransfusie!
RNA genoomstructuur
• dsRNA: vb rotavirus, niet veel dsRNA
• ssRNA: meest voorkomend, vb mazelenvirus
,Circulaire genoomstructuur
• Circulair dsDNA: vb papillomavirus
• Circulair ssRNA: lijkt ds maar is circulair (deels ds), vb plant viroiden (want
geen eiwitmantel)
Hepatitis B virus
= speciaal virus, is in de cel zelf dubbelstrengig
en circulair
→ In partikel zelf 2/3 dubbel en 1/3
enkelstrengig
Segmentaire genoomstructuur
• Vb rotavirus: 11 segmenten
• Vb griepvirus: 8 RNA segmenten
• Vb hantavirus: 3 segmenten
→ Voordeel om met andere virussen van dezelfde soort materiaal uit te wisselen → virus kan
heel snel evolueren
→ Hantavirussen enkel in de bossen in de Kempen, door uitwerpselen van muizen
→ Acuut nierfalen, maar recuperatie = niet dood meestal
• Laten dus toe om deeltjes uit te wisselen = reassortering
→ Bij een pandemie vaak een virus dat op een of andere manier
gereassorteerd is
Tabel:
Virus taxonomie
• Naamgeving door het ICTV = International Committee on Taxonomy of Viruses
Virale replicatie
• Doel van een virus: repliceren
→ Hebben een gastheercel nodig om aan replicatie te doen (gijzelen een cel voor eigen
doeleinden)
,Virale replicatiecyclus
Binding aan cellulaire receptor
• Sleutelslotmechanisme: eerst vasthangen dan pas opname
→ Niet zo eenvoudig: meerdere receptoren spelen een rol
• Receptor zit niet op een cel om virus binnen te laten → heeft een
andere functie
Binnendringen in doelwitcel
Fusie van geënveloppeerd virus met plasmamembraan
• Virus komt naakt in de cel,
vrij eenvoudig
• Soms zo binnen door
gewoon op de celwand te liggen
(cel is nieuwsgierig en laat binnen)
Endocytose van een niet-geënveloppeerd virus
• Eens in de cel een
geënveloppeerd virus, kan
fusioneren met
plasmamembranen in de cel
(Golgi)
Endocytose van een geënveloppeerd virus
• Dan krijg je een dubbellaag
• Gaat met een lysosoom versmelten
→ pH zakt en envelope fusioneert met
endocytoplasmatisch vesikel
→ Zo een naakt virus in het cytoplasma
Injecteren van viraal genoom in doelwitcel
= bacteriofagen
Ontmanteling van het virus
• Meestal spontaan (in uren of dagen)
,Synthese ‘vroege’ eiwitten – viraal DNA/RNA replicatie – synthese ‘late’ eiwitten
• Gijzelingsproces = het overnemen van de cel voor eigen doeleinden
• Vroege eiwitten: eiwitten nodig om verdere replicatie te doen
• Late eiwitten: capside-eiwitten
•
Assemblage nieuwe virions
• Gaan opstapelen in de cel
→ Als envelope nodig: tegen de celwand
gaan liggen (anders gewoon in cel)
Vrijzetting nieuwe virions
• Celvriendelijke manier: budding
→ Voor virussen die langer aanwezig zijn
→ Envelope w gemaakt
→ Gaat trager
→ Cel wordt als maar krapper en zonder voldoende
celwandsynthese (want teveel energie nodig) sterft de
cel toch
• Niet-celvriendelijke manier: cel opblazen
→ Vaak acute symptomen, plots duizenden virions
Diagnositiek
• Rechtstreeks: aantonen van een virus → liefst dit, maar niet altijd mogelijk
• Onrechtstreeks: aantonen van antistoffen → tragere manier, duurt 10-14d voor aanwezig pas
Rechtstreeks: aantonen van een virus
Elektronenmicroscopie
• Duur en bewerkelijk → maar als foto vaak ook diagnose (of denkrichting)
• Veel info uit dat eerste beeld
• Niet simpel, is specialistenwerk
• Drager = een klein gridje
→ Oppervlaktespanning houdt vloeistof vast → visualisatie
→ Randjes van het gridje amper zichbaar door de grote vergroting
→ Kleuren met een speciale (kleurloze) vloeistof: osmiumtetroxide
• Heel duur toestel nodig: meestal in het donker
Immuno-elektonenmicroscoop
• Sommige virussen komen niet veel voor in een staal → gridjes behandelen met antilichamen
tegen hetgeen je naar op zoek bent (enkel als je goed idee hebt wat het zou zijn)
→ Virussen gaan klonteren en zijn makkelijker te vinden
Virale kweek op celcultuur
• Was heel belangrijk, nu minder
• Nu: groeien heel goed op eieren, dienen als soort biofabrieken om virus te vermenigvuldigen
→ Wordt nog veel gebruikt voor influenza virus
• Celcultuur op individuele cellen gebeurt ook nog veel
, → Vroeger apenniercellen gebruikt hiervoor (african green monkey kidney cells)
→ Trypsine bijdoet dat de virussen uit het celverband haalt, dan op ijs mee werken → zo
individuele cellen isoleren en beginnen kweken
• Celcultuur incubatie:
• Na 7d = confluente laag cellen
→ splitsen
• Trypsinisatie:
• Contact inhibitie: als ze voelen dat er al een andere cel zit gaan ze stoppen met delen →
vormen maar 1 laag
→ Kankercellen hebben geen contactinhibitie: blijven oneindig groeien in goeie
omstandigheden
Drie soorten cellijnen
• Primaire cellijn: monkey kidney cellen
→ Kunnen maar 1-2 keer splitsen, dan dood (steeds nieuwe voorraad nodig)
• Semi-continue cellijn: human embryonic kidney, fibroblasten
→ Kunnen 50 keer splitsen: als je vroege passages invriest kun je jaren verder (uiteindelijk
wel nieuwe cellijn nodig)
• Continue cellijn: HeLa (Henrietta Lacks), Vero, Hep2
→ Kunnen een oneindig aantal keer splitsen
→ HeLa: vrouw die stierf aan baarmoederhalskanker, in elk labo gebruikt overal ter wereld
• Cellen kweken in een broedstof op 37°, in celcultuur medium bij neutrale pH
→ Nutriënten in het medium: suikers, groeifactoren
→ Optimum voor menselijke cellen (niet rhinovirussen → 28-30° in de neus)
• Kleur/pH indicator: normaal oranje
→ Als geel: teveel afvalstoffen, teveel cellen of een bacterie
→ Als roze: te weinig CO2, wordt alkalisch
Werkbanken: verschillende soorten
• Horizontale laminar flow clean air werkbank:
→Kan wel voor bacterieplaten die je steriel moet gieten (geen
bacteriën van buiten naar binnen)
→ Geen goed idee om hierin met virussen te werken!
,• Klasse I microbiologische veiligheidswerkbank:
→ Heeft een HEPA filter, zuigt lucht aan vanuit omgeving
→ Niet ideaal voor materiaal dat je steriel wil houden
→ Onderzoeker wel veilig, lucht niet naar jouw kant
→ Niet werken met gevaarlijke virussen
• Klasse II microbiologische veiligheidswerkbank:
→ Verticaal luchtgordijn die kast afsluit + HEPA filter die lucht wegzuigt
→ Perfect voor steriele, matig gevaarlijke virussen
→ Slechts beperkt deel voor handen, als je in gaat creër je turbulentie in
gordijn = gevaarlijk
• Klasse III microbiologische veiligheidswerkbank:
→ Met ingewerkte handschoenen, niet zo handig
→ Glovebox (lovebox pun, deel vd tekst was afgevallen)
→ Veilig, met 2 HEPA filters, alles erin blijft steriel = voor gevaarlijke virussen
Cytopathogeen effect
• Plaque (cellysis): het effect zien van dode cellen door het virus
→ Virus w overgedragen en later is die eerste cel dood
→ Op den duur leegte waar dode cellen zaten
! Virustitratie op celcultuur!
→ Verdunningen maken: stalen met veel en weinig virus bepalen
• Kerninclusies: grote donkere massa’s in sommige kernen
→ Opstapeling van bepaalde intranucleaire virussen
• Cytoplasma inclusies: inclusies in het cytoplasma
→ Massa in het cytoplasma duwt kern in = geen ronde kern meer
• Reuscellen/syncytia
→ Soort van cytofagocytose waar een cel een andere cel
(met virussen) gaat opnemen
→ Uiteindelijk krijg je een conglomeraat (vb mazelen of
CMV)
,• Cave: artefacten!
→ Cellen die nog niet confluent zijn
→ Zijn gewoon mitoses
→ Cel die delen kleurstof heeft opgenomen (bij teveel toevoeging
van kleurstof)
Niet-CPE methoden
• Niet elk virus heeft een CPE effect
• Hemadsorptie: sommige cellen brengen hemaglutinines aan
oppervlak
→ Deze binden RBC en zo wordt de cel gemerkt
• Immunofluorescentie: ook met antilichamen (gaan groen
kleuren)
→ Kan je doen als je al een idee hebt welk virus het zou kunnen zijn
Antigeendetectie
Immunofluorescentie
• Net hetzelfde, maar je zoekt hier naar specifieke virussen
Immunochromatografie
• Werkt zoals zwangerschapstesten
→ Je zoekt met gelabelde antilichamen naar antigenen in een preparaat
Hemagglutinatie
• Enkel bij virussen met hemagglutinine op het oppervlak
→ Als de RBC dan als een soort netwerkt verbonden zijn → soort tapijtje op de onderkant
van proefbuis (anders gewoon een puntje)
ELISA
Genoomdetectie
• Meer en meer belangrijk geworden = moleculaire diagnostiek voor genetisch materiaal van
virussen aan te tonen
In situ hybridisatie
• Met radioactive labels gaat het radioactief materiaal binden aan het virus
→ Zien op een coupe waar ze zitten
Kwalitatieve testen
• PCR (momenteel heel kleine toestellen zeggen of het aanwezig is of niet het virus)
Kwantitatieve testen
• Hoeveel er is, totaal niet van belang als je geen behandeling hebt
,Genotypering
• Weten vb welk coronavirus etc via sequentiebepaling, zeer moeilijk
• Nu een fluitje van een cent, machine niet groter dan een USB stick
• Veel gedaan tijdens corona: om te weten welk subtype het was
→ Zo ook filogenetisch onderzoek doen: stambomen maken (gebaseerd op
nucleotidesequenties)
Onrechtstreeks: aantonen van antistoffen
• Je toont de reactie van het immuunsysteem
Immunofluorescentie
→ Je kan ook al met de secundaire die gaan opsporen
Hemagglutinatie inhibitie
→ Ze gaan al binden op de virussen, RBC kunnen
niet binden
→ Zo kom je tot een titer
Complementfixatie
ELISA
Seroneutralisatie
• Cellen die een monolayer vormen met een medium erboven, virussen doden de cellen en er
zit niets meer op de bodem
• Als toevoeging van antilichamen: geen infectie, cellen blijven leven op het oppervlak
, Deel 2: Influenza en COVID-19
• Influenza = duidelijk anders dan een verkoudheid
→ Eerste paar dagen niets doen, geen eetlust, in donker willen zijn → beter na een paar
dagen
• Overgedragen als druppeltjes infectie via bio-aerosolen, altijd van iemand anders griep
krijgen
• Vermijden: handen wassen (geen enorme hulp…), 1.5m afstand
→ Deel vd overdracht via handen (handen naar ogen, 1/10 met handen aan hoofd)
→ Na 1.5m druppeltjes onder mond gezakt, maar enkel in theorie (in binnenruimte veel
verder, afh van luchtcirculatie, ventilatie…)
• Kinderen zijn vectoren ve griepepidemie: van kinderen naar ouders, ouders mee naar het
werk, van werk naar niet werkende bevolking → ouderen vaak in de 2e helft van de epidimie
• Voorbeeld op de ‘Diamond Princess’: zelf bij quarantine ging de epidemie verder →
verplaatsing via slechte ventilatie
→ Ook uit experimenten met restaurant:
→ Mensen in rood werden ziek, zaten parallel
met man bij de airco
→ Ventilatie is belangrijk: raam open zetten,
continue verdunning van viruspartikeltjes
→ Een proxy: CO2 gehalte, in normale
omgeving 450-500, hoe hoger hoe meer
recyclage van uitgeademde lucht en dus ook de
viruspartikels
Influenza di freddo
• Influenza = invloed; di freddo = van de koude (want komt vooral voor in de winter)
• Kwam eerste keer in een document in 1743 voor, spreekt over een pandemie
→ Zinloze naam want betekent gewoon invloed?
→ Ofwel gaat iedereen dood ofwel gaat het over
→ Quarantaine = 40d stilstand van mensen en goederen (enige dat men destijds kon doen
• In Parijs: grippings (daarvan ons woord griep)
→ Gripper = grijpen, het gebeurt plots, het overvalt je (’s morgens dik ok, ’s avonds plots
slecht) → bij verkoudheid is het beginpunt veel minder duidelijk
Morfologie
• Heeft een evelope, met aantal eiwitten:
→ Hemagglutinin: het H eiwit, nodig om aan een cel
te kunnen hangen
