ANALYTISCHE BIOCHEMIE I
INHOUDSOPGAVE
1 – Inleiding .................................................................................................................................. 4
Doel ................................................................................................................................................4
Design van een biochemisch experiment ..........................................................................................5
Meeteenheden ................................................................................................................................9
Concentraties .................................................................................................................................9
Elektrolyten ................................................................................................................................... 14
Activiteit en activiteitscoëfficiënt .................................................................................................... 15
2.1 – Celcultivatie ........................................................................................................................17
Inleiding ........................................................................................................................................ 17
Wat is celcultivatie?................................................................................................................... 17
Waarom celcultuur? .................................................................................................................. 17
Specifieke toepassingen ............................................................................................................ 18
Soorten celcultuur ..................................................................................................................... 19
Basisapparatuur ............................................................................................................................ 22
Recipiënten ............................................................................................................................... 22
Laminaire flow ........................................................................................................................... 24
Risicobeoordeling celcultuur ..................................................................................................... 25
Incubator .................................................................................................................................. 28
Groeivoorwaarden ......................................................................................................................... 28
Celcultuurmedium .................................................................................................................... 28
Groeikinetiek ................................................................................................................................. 29
Oefeningen ................................................................................................................................... 31
Toepassingen ................................................................................................................................ 32
Subcultivatie/passage ............................................................................................................... 32
Wondheling – celmigratie – celmotiliteitstest .............................................................................. 33
Celmigratie – invasie – metastasetest: Boyden Chamber test of transwell test .............................. 34
Kolonie groeitest of clonogenic assay ......................................................................................... 34
Primaire osteoblastcultuur: model voor in vitro osteogenese ....................................................... 35
Primaire humane niercelcultuur ................................................................................................. 36
Organoïden ............................................................................................................................... 39
Invriezen van cellen ....................................................................................................................... 39
Celtelling ...................................................................................................................................... 41
Hemocytometer ........................................................................................................................ 41
Coulter* counter ....................................................................................................................... 41
Hayflick limiet ........................................................................................................................... 41
MTT celproliferatietest ............................................................................................................... 42
1
,2.2 – Celfractionatie.....................................................................................................................43
Zuiveren van cellen ........................................................................................................................ 43
Centrifugatie op gradiënt ........................................................................................................... 43
Immunomagnetische scheiding ................................................................................................. 44
Celsortering: flowcytometrie ...................................................................................................... 45
Zuiveren van celorganellen ............................................................................................................. 47
Homogenisatiemedium ............................................................................................................. 47
Homogenisatietechnieken ......................................................................................................... 48
Mechanisch .......................................................................................................................... 48
Enzymatisch ......................................................................................................................... 50
Detergenten .......................................................................................................................... 50
Fractionatie cel-/weefselhomogenaat ........................................................................................ 51
3 – Scheiding en zuivering van biomoleculen .................................................................................52
Inleiding filtratie ............................................................................................................................. 52
Dieptefilters .................................................................................................................................. 52
Oppervlakte- of membraanfilters .................................................................................................... 53
Dialyse .......................................................................................................................................... 57
Ultrafiltratie ................................................................................................................................... 59
Precipitatie van eiwitten ................................................................................................................. 63
4 – Centrifugatie ..........................................................................................................................70
Differentiële centrifugatie ............................................................................................................... 75
Densiteitsgradiënt centrifugatie ...................................................................................................... 76
Ultracentrifugatie ........................................................................................................................... 78
Oefeningen ................................................................................................................................... 81
5 – Chromatografie ......................................................................................................................84
Theoretische beschrijving van chromatografie ................................................................................. 85
Distributiecoëfficiënten & verdelingsisothermen ......................................................................... 85
De lineaire snelheid & retentietijd ............................................................................................... 86
Concept van theoretische platen ................................................................................................ 89
Bandverbreding & kolomefficiëntie ............................................................................................. 90
Chromatografische resolutie ...................................................................................................... 93
Chromatografie en druk ............................................................................................................. 96
Indeling van de chromatografische methoden ................................................................................. 98
Kolomchromatografie ................................................................................................................ 98
Chromatografische apparatuur .............................................................................................. 98
Stationaire fase ................................................................................................................... 100
Elutiemethoden .................................................................................................................. 105
Voornaamste types van kolomchromatografie ...................................................................... 106
Ionenuitwisselingschromatografie ................................................................................... 106
Gelfiltratie of moleculaire zeefchromatografie of gelpermeatie .......................................... 108
Hydrofobe chromatografie ............................................................................................... 110
2
, Affiniteitschromatografie ................................................................................................. 116
Gaschromatografie .................................................................................................................. 120
Principe .............................................................................................................................. 120
Scheiding van carbohydraten door gaschromatografie .......................................................... 122
Scheiding van lipiden door gaschromatografie ...................................................................... 123
Dunlaagchromatografie ........................................................................................................... 123
Principe .............................................................................................................................. 123
Dunlaagchromatografie van aminozuren .............................................................................. 124
Dunlaagchromatografie van carbohydraten .......................................................................... 125
Dunlaagchromatografie van lipiden ...................................................................................... 125
Oefeningen ................................................................................................................................. 126
6 – Elektroforese ........................................................................................................................ 133
Principe ...................................................................................................................................... 133
Dunne laag elektroforese ............................................................................................................. 135
Gelelektroforese .......................................................................................................................... 136
Agarosegelelektroforese .......................................................................................................... 136
Polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) .................................................................................... 141
Downstream toepassingen ........................................................................................................... 153
Western blotting (eiwitten) ....................................................................................................... 153
Southern blotting (DNA) & Nothern blotting (RNA) ...................................................................... 155
Capillaire elektroforese ................................................................................................................ 156
Voorbeeld examenvragen .......................................................................................................... 159
Vraag 1 ........................................................................................................................................ 159
Vraag 2 ........................................................................................................................................ 160
Vraag 3 ........................................................................................................................................ 161
Vraag 4 ........................................................................................................................................ 162
Vraag 5 ........................................................................................................................................ 163
Vraag 6 ........................................................................................................................................ 164
Vraag 7 ........................................................................................................................................ 166
Vraag 8 ........................................................................................................................................ 167
Vraag 9 ........................................................................................................................................ 168
Oude examenvragen (2024-2025) ................................................................................................ 169
1e zit ............................................................................................................................................ 169
2e zit ............................................................................................................................................ 169
3
,1 – INLEIDING
• Evaluatie: schriftelijk examen
o Kennisvragen
▪ Bvb leg techniek uit
o Toepassingsvragen
o Inzichtsvragen
▪ Bvb schetsing probleem en adhv techniek oplossen
▪ Dus ook begrijpen wanneer je welke techniek toepast en wat voor-
en nadelen zijn
o Vraagstukken
▪ Bvb berekening concentratie
DOEL
• Doel analytische biochemie
o Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met
als doel het begrijpen van het moleculaire werkingsmechanisme van de
cel
▪ Chemische processen zoals metabole processen
▪ Levende organismen: mens, bacterie, …
▪ Adhv welke processen en biomoleculen betrokken kies je correcte
techniek
o Wat kunnen we bestuderen:
▪ Structurele, kinetische & thermodynamische eigenschappen van
moleculen in een levend organisme
Bvb voorspelling 3D-structuur
Bvb hoe werkt molecule in levend organisme
▪ De functie van deze moleculen en de mechanismen waarmee ze
andere moleculen herkennen en ermee interageren met vorming
van anabole, katabole, signalisatie, immunologische en andere
pathways die karakteristiek zijn voor levende organismen
▪ De pathways verantwoordelijk voor synthese en degradatie van
deze moleculen en de mechanismen verantwoordelijk voor de
fouten in deze pathways
▪ De energetica van biologische processen zoals transport over
celmembraan, productie van cellulaire energie, energie omzetting
en uitwisseling van energie tussen verschillende
celcompartimenten en/of met het extracellulair milieu
→ antwoord op hypothese die we stellen
4
, • Doel van biochemische analyse
o Technieken die hierbij aan bod komen omvatten zowel
▪ Staalvoorbereiding
Welke stalen, hoeveel ervan, zuiverheid, oorsprong, …
▪ Zuivering & isolatie van bio-componenten uit dit staal
Moet je bio-component isoleren uit staal of kan je staal zo
gebruiken?
Elke stap is verlies (& evt aanpassing) van materiaal dus je
voert alleen noodzakelijke stappen uit
▪ Identificatie, karakterisatie en evt ook kwantificatie van deze bio-
componenten
o In vitro (eenvoudiger, gemakkelijker om te interpreteren, maar minder
overeenkomst met fysiologische situatie) en in vivo systemen
▪ In vitro: eenvoudiger om deelaspecten te bestuderen,
gemakkelijker interpreteerbaar → elk resultaat dat je in vitro
bekomt moet je valideren met in vivo systeem: is complexer
systeem, dus heeft invloed op experiment
▪ Maar niet meteen in vivo: is heel complex, kostbaar
▪ Eerst veel dingen in vitro uitproberen
DESIGN VAN EEN BIOCHEMISCH EXPERIMENT
• Hoe ontwikkelen van een goed biochemisch experiment?
• Stap 1: wat willen we onderzoeken?
o Kan heel breed zijn: bvb therapeuticum voor borstkanker → kan niet met 1
onderzoek → je verdeelt het onder in kleine onderzoeksvragen
o Identificatie van het onderwerp
o Vb: OZ naar een nieuwe mutatie in het ADNP-eiwit
• Stap 2: wat is er al geweten over dit onderwerp? → literatuurOZ
o Sterktes/zwaktes van de reeds gebruikte methodologieën en
vooropgestelde hypothesen
o Vb: is de mutatie al gekend? Zijn er al andere mutaties gekend in het
ADNP-eiwit? Hoe hebben ze deze onderzocht, welke technieken? Indien
niet: mutaties in andere eiwitten, hoe bestudeerd?
o Kritisch zijn over gepubliceerde papers
▪ Kan zijn dat resultaat eerst verschillende keren mislukt is en ze
enkel de ene keer tonen wanneer het goed was
• Stap 3: welke hypothese willen we testen? Wat is de vraagstelling?
o Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment
gepland werd
5
, o Vb: heeft de gevonden mutatie effect op de lengte van het ADNP-eiwit? →
je wil dus lengte van het eiwit bestuderen
▪ Kon bvb ook functie zijn van eiwit ipv lengte maar dan moet de fct
dus al wel gekend zijn
• Stap 4: welk biologisch systeem gaan we gebruiken?
o Species
o In vitro/in vivo
o Vb: effect van mutatie in humaan systeem dus als je onderzoekt bij mens
zit je dichtst bij vraagstelling
▪ Probleem: ADNP-eiwit komt vnl voor in neuronaal/hersen weefsel
→ moeilijk om aan humane stalen te komen
▪ Transgene muismodellen waarin mutatie aanwezig is? = in vivo
▪ Celculturen van hersencellen waar eiwit in aanwezig is waarin je
het bvb kan overexpresseren voor veel materiaal = in vitro
• Stap 5: welke variabele bestuderen we?
o Hoe zorgen we ervoor dat alle andere parameters stabiel zijn zodat de
gekozen variabele de enige is die de uitkomst van het experiment bepaalt?
o Zijn er andere variabelen buiten degene die we willen bestuderen?
o Identificatie van variabele die bestudeerd wordt + controle van
omgevingsparameters
o Transgene muis vegergelijken met wildtype muis, zelfde ras van muis,
liefst ook muizen van zelfde nestje, indien niet mogelijk wel muizen van
zelfde leeftijd nemen → alle variabelen zo stabiel mogelijk om de variatie
die er sowieso is tussen verschillende individuen zo stabiel mogelijk te
houden
o Vb: te bestuderen variabele = moleculair gewicht van het eiwit
▪ Andere zaken om rekening mee te houden: lading van eiwit, andere
contaminerende eiwitten/moleculen
▪ Hoeveelheid staal nodig
• Stap 6: design van het experiment
o Welke materialen/apparatuur hebben we zelf in labo?
o Welke apparatuur kunnen we gebruiken van andere onderzoeksgroepen?
▪ Of uitbesteding aan bedrijf indien je het zelf echt niet kan doen
o Welke kalibraties hebben we nodig? Welke controles?
o Kostprijs
o Veiligheidsvoorschriften?
o Ethische dossiers, vergunningen, trainingen?
▪ Bvb vergunning ethanol dat we het niet gebruiken om alcohol mee
te maken
6
,• Technieken: hoe kunnen we het moleculair gewicht van een eiwit bepalen?
o Massaspectrometrie
▪ Voordelen:
Zeer gevoelig & nauwkeurig
Zeer exacte bepaling van het moleculair gewicht
▪ Nadelen:
Duur
Tijdsintensief
Zeer dure toestellen → niet in elk labo aanwezig
Lange training → werk uitbesteden
Biologisch staal moet gezuiverd worden van andere
contaminerende eiwitten (anders voor elke bio-component
erin een moleculair gewicht)
o Analytische gelfiltratie chromatografie
▪ Voordelen:
Methode gevoelig genoeg om het moleculair gewicht
nauwkeurig te bepalen (mits goede kalibratie van de kolom)
– Eerst eiwitten op kolom scheiden waarvan je
moleculair gewicht exact kent
Biologisch staal moet niet gezuiverd worden van andere
contaminerende eiwitten
– Want hebben verschillende moleculaire gewichten
en je scheidt eiwitten obv moleculair gewicht
▪ Nadelen:
HLPC toestel nodig (duur + training)
Hoe kan ik het ADNP-eiwit detecteren? → analytische test
aan koppelen
– Je kan niet zeker zeggen dat eiwit met bep moleculair
gewicht het ADNP-eiwit is
o SDS-PAGE en Western blotting
▪ Voordelen:
Methode gevoelig genoeg om moleculair gewicht te bepalen
Biologisch staal moet niet gezuiverd worden van
contaminerende eiwitten
Eenvoudig uit te voeren
Relatief goedkope techniek met standaard labomateriaal
▪ Nadelen:
Er moet een kwalitatief antilichaam tegen ADNP
beschikbaar zijn
→ Wij kiezen SDS-PAGE en Western blotting
7
,• Stap 7: uitvoering van het experiment
o Nauwkeurig, reproduceerbaar
o Kritisch voor uitvoering en handelingen
o Met inbegrip van passende kalibraties & controles
o Elke stap nauwkeurig uitvoeren volgens de opgezochte protocollen
o Positieve controle (= staal dat zeker WT ADNP bevat) en negatieve
controle toepassen
▪ Pos controle moet signaal geven, anders is er iets fout met
experiment
▪ Neg controle is deel van experiment waarvan je geen signaal
verwacht → als je wel signaal krijgt, is het aspecifiek signaal (zeker
als je met antilichamen werkt kan dit)
• Stap 8: analyse van de resultaten
o Kritisch voor bekomen resultaten
o Statistische testen nodig?
▪ Soms hangt # meegenomen stalen af van statistische test die je
toepast
o Vb resultaat
▪ WT heeft lengte van ong 150 kD
▪ Mutante eiwit heeft lengte van rond 75 kD
Groot verschil in moleculair gewicht
▪ Bovenaan heel licht bandje thv WT, dus zelfs in mutante vorm komt
lage c van WT nog tot expressie
• Stap 9: wat kunnen we besluiten uit de resultaten?
o Herhaling nodig? Extra experimenten nodig? Terugkoppeling
vraagstelling?
▪ Je kan nooit iets publiceren dat je maar 1x doet, minstens 1x
herhaling
o Vb: moleculair gewicht van eiwit is ong 75kD lager dan dat van WT eiwit
• Stap 10: nieuwe hypothesen / toekomstige experimenten
o Vloeit voort uit studie
o Opnieuw naar stap 3 van formulering van vraagstelling/hypothese
8
, • Enkele belangrijke opmerkingen
o Notities nemen doorheen het hele proces!
o Controles: steeds meenemen, anders is het experiment waardeloos!
▪ Pos controle: nagaan of het testsysteem werkt
Belangrijk wanneer resultaat neg is
Soms zoek je neg antwoord bvb eiwit dat niet tot expressie
hoort te komen maar je moet weten of dit niet gewoon neg is
omdat de test niet goed werkt
▪ Neg controle: nagaan of het resultaat louter en alleen het gevolg is
van de test (bvb geen contaminatie)
Belangrijk wanneer pos aanwezig is
Bvb dat Al niet aspecifiek bindt
▪ Andere controles: bvb op parameters die moeilijk gelijk te houden
zijn, vergelijking met andere stalen, voor normalisatie (bvb met een
zelfde experiment dat wordt uitgevoerd op ander tijdstip), enz
MEETEENHEDEN
• SI Units (Système Internationale d’Unités): algemeen aanvaarde eenheden,
kunnen worden geconverteerd naar andere units of door conversie uit andere
units verkregen worden
CONCENTRATIES
• Concentratie van een oplossing
o Oplossing = homogeen mengsel van één of meerdere substanties
(solutes) in een vloeibare component (solvent)
o De concentratie van de substanties in de oplossing geeft de hoeveelheid
weer van elke substantie in een bepaalde hoeveelheid solvent (gewicht of
volume)
9
, • Eenheid van concentratie
o Gewoonlijk weight/volume (w/v), soms v/v of w/w (bvb g/l)
▪ Bij w/w moet je rekening houden met dichtheid (bij water 1000 dus
gemakkelijk)
o In percentage waarbij w/v of w/w vermenigvuldigd wordt met 100
▪ w/v: 1% NaCl opl = 1 g NaCl in 100 cm3 of 100 ml water
o Parts per million (ppm) of parts per billion (ppb) (pas op: one billion = 1
miljard), kan uitgedrukt worden in w/v, w/w, w/cm3
o Vb: lucht bevat 8 ppm CO (8 cm3 CO per miljoen cm3 lucht)
▪ 1 g water = equivalent met 1 cm3 dus een substantie van 8 ppm in
water =
8 g in 106 g water (w/w)
8 g in 106 cm3 water (w/cm3)
8 g in 1000 dm3 water
8 mg in 1 dm3 water of 8 mg in 1 l water (w/v)
8 µg in 1 cm3 water of 8 µg in 1 ml water
8 ng in 1 mm3 water
• Mol & molaire massa
o Mol = eenheid voor chemische hoeveelheid
▪ 1 mol = de hoeveelheid van een substantie die 6,022 x 1023
moleculen bevat (getal van Avogrado of NA)
o Molaire massa = massa van 1 mol van een stof
▪ Molaire massa (MW) = de atomaire massa * 1 g/mol dus MW HCl =
36,45 g/mol
• Het begrip molariteit
o Molariteit van een oplossing = mol per liter = # g/molaire massa
3 𝑔/𝑙 𝐻𝐶𝑙
▪ Bvb = 0,08 mol/l of M
36,46 𝑔/𝑚𝑜𝑙
o SI voor concentratie = mol/m3 maar voor biochemische toepassingen:
▪ mol/dm3 = mol/liter = molariteit (M)
o Aangezien biologische substanties gewoonlijk bij relatief lage
concentraties voorkomen en de volumes ook klein zijn, liggen
experimentele oplossingen eerder in het mmol/dm3 (mM), µmol/dm3 (nM)
gebied
o Verdunningen maakt men uit hoger geconcentreerde oplossingen via
formule M1.V1 = M2.V2 met M1 en M2 initiële en finale molariteit en V1 en V2
initieel en finaal volume
o Vb: verdun een stockoplossing van 0,5 mol/l naar 0,025 mol/l met
eindvolume 250 ml
▪ V1 = (M2.V2)/M1
▪ V1 = (0,025 mol/l.0,25 l) / 0,5 mol/l = 0,0125 l stock + 0,2375 l water
10
INHOUDSOPGAVE
1 – Inleiding .................................................................................................................................. 4
Doel ................................................................................................................................................4
Design van een biochemisch experiment ..........................................................................................5
Meeteenheden ................................................................................................................................9
Concentraties .................................................................................................................................9
Elektrolyten ................................................................................................................................... 14
Activiteit en activiteitscoëfficiënt .................................................................................................... 15
2.1 – Celcultivatie ........................................................................................................................17
Inleiding ........................................................................................................................................ 17
Wat is celcultivatie?................................................................................................................... 17
Waarom celcultuur? .................................................................................................................. 17
Specifieke toepassingen ............................................................................................................ 18
Soorten celcultuur ..................................................................................................................... 19
Basisapparatuur ............................................................................................................................ 22
Recipiënten ............................................................................................................................... 22
Laminaire flow ........................................................................................................................... 24
Risicobeoordeling celcultuur ..................................................................................................... 25
Incubator .................................................................................................................................. 28
Groeivoorwaarden ......................................................................................................................... 28
Celcultuurmedium .................................................................................................................... 28
Groeikinetiek ................................................................................................................................. 29
Oefeningen ................................................................................................................................... 31
Toepassingen ................................................................................................................................ 32
Subcultivatie/passage ............................................................................................................... 32
Wondheling – celmigratie – celmotiliteitstest .............................................................................. 33
Celmigratie – invasie – metastasetest: Boyden Chamber test of transwell test .............................. 34
Kolonie groeitest of clonogenic assay ......................................................................................... 34
Primaire osteoblastcultuur: model voor in vitro osteogenese ....................................................... 35
Primaire humane niercelcultuur ................................................................................................. 36
Organoïden ............................................................................................................................... 39
Invriezen van cellen ....................................................................................................................... 39
Celtelling ...................................................................................................................................... 41
Hemocytometer ........................................................................................................................ 41
Coulter* counter ....................................................................................................................... 41
Hayflick limiet ........................................................................................................................... 41
MTT celproliferatietest ............................................................................................................... 42
1
,2.2 – Celfractionatie.....................................................................................................................43
Zuiveren van cellen ........................................................................................................................ 43
Centrifugatie op gradiënt ........................................................................................................... 43
Immunomagnetische scheiding ................................................................................................. 44
Celsortering: flowcytometrie ...................................................................................................... 45
Zuiveren van celorganellen ............................................................................................................. 47
Homogenisatiemedium ............................................................................................................. 47
Homogenisatietechnieken ......................................................................................................... 48
Mechanisch .......................................................................................................................... 48
Enzymatisch ......................................................................................................................... 50
Detergenten .......................................................................................................................... 50
Fractionatie cel-/weefselhomogenaat ........................................................................................ 51
3 – Scheiding en zuivering van biomoleculen .................................................................................52
Inleiding filtratie ............................................................................................................................. 52
Dieptefilters .................................................................................................................................. 52
Oppervlakte- of membraanfilters .................................................................................................... 53
Dialyse .......................................................................................................................................... 57
Ultrafiltratie ................................................................................................................................... 59
Precipitatie van eiwitten ................................................................................................................. 63
4 – Centrifugatie ..........................................................................................................................70
Differentiële centrifugatie ............................................................................................................... 75
Densiteitsgradiënt centrifugatie ...................................................................................................... 76
Ultracentrifugatie ........................................................................................................................... 78
Oefeningen ................................................................................................................................... 81
5 – Chromatografie ......................................................................................................................84
Theoretische beschrijving van chromatografie ................................................................................. 85
Distributiecoëfficiënten & verdelingsisothermen ......................................................................... 85
De lineaire snelheid & retentietijd ............................................................................................... 86
Concept van theoretische platen ................................................................................................ 89
Bandverbreding & kolomefficiëntie ............................................................................................. 90
Chromatografische resolutie ...................................................................................................... 93
Chromatografie en druk ............................................................................................................. 96
Indeling van de chromatografische methoden ................................................................................. 98
Kolomchromatografie ................................................................................................................ 98
Chromatografische apparatuur .............................................................................................. 98
Stationaire fase ................................................................................................................... 100
Elutiemethoden .................................................................................................................. 105
Voornaamste types van kolomchromatografie ...................................................................... 106
Ionenuitwisselingschromatografie ................................................................................... 106
Gelfiltratie of moleculaire zeefchromatografie of gelpermeatie .......................................... 108
Hydrofobe chromatografie ............................................................................................... 110
2
, Affiniteitschromatografie ................................................................................................. 116
Gaschromatografie .................................................................................................................. 120
Principe .............................................................................................................................. 120
Scheiding van carbohydraten door gaschromatografie .......................................................... 122
Scheiding van lipiden door gaschromatografie ...................................................................... 123
Dunlaagchromatografie ........................................................................................................... 123
Principe .............................................................................................................................. 123
Dunlaagchromatografie van aminozuren .............................................................................. 124
Dunlaagchromatografie van carbohydraten .......................................................................... 125
Dunlaagchromatografie van lipiden ...................................................................................... 125
Oefeningen ................................................................................................................................. 126
6 – Elektroforese ........................................................................................................................ 133
Principe ...................................................................................................................................... 133
Dunne laag elektroforese ............................................................................................................. 135
Gelelektroforese .......................................................................................................................... 136
Agarosegelelektroforese .......................................................................................................... 136
Polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) .................................................................................... 141
Downstream toepassingen ........................................................................................................... 153
Western blotting (eiwitten) ....................................................................................................... 153
Southern blotting (DNA) & Nothern blotting (RNA) ...................................................................... 155
Capillaire elektroforese ................................................................................................................ 156
Voorbeeld examenvragen .......................................................................................................... 159
Vraag 1 ........................................................................................................................................ 159
Vraag 2 ........................................................................................................................................ 160
Vraag 3 ........................................................................................................................................ 161
Vraag 4 ........................................................................................................................................ 162
Vraag 5 ........................................................................................................................................ 163
Vraag 6 ........................................................................................................................................ 164
Vraag 7 ........................................................................................................................................ 166
Vraag 8 ........................................................................................................................................ 167
Vraag 9 ........................................................................................................................................ 168
Oude examenvragen (2024-2025) ................................................................................................ 169
1e zit ............................................................................................................................................ 169
2e zit ............................................................................................................................................ 169
3
,1 – INLEIDING
• Evaluatie: schriftelijk examen
o Kennisvragen
▪ Bvb leg techniek uit
o Toepassingsvragen
o Inzichtsvragen
▪ Bvb schetsing probleem en adhv techniek oplossen
▪ Dus ook begrijpen wanneer je welke techniek toepast en wat voor-
en nadelen zijn
o Vraagstukken
▪ Bvb berekening concentratie
DOEL
• Doel analytische biochemie
o Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met
als doel het begrijpen van het moleculaire werkingsmechanisme van de
cel
▪ Chemische processen zoals metabole processen
▪ Levende organismen: mens, bacterie, …
▪ Adhv welke processen en biomoleculen betrokken kies je correcte
techniek
o Wat kunnen we bestuderen:
▪ Structurele, kinetische & thermodynamische eigenschappen van
moleculen in een levend organisme
Bvb voorspelling 3D-structuur
Bvb hoe werkt molecule in levend organisme
▪ De functie van deze moleculen en de mechanismen waarmee ze
andere moleculen herkennen en ermee interageren met vorming
van anabole, katabole, signalisatie, immunologische en andere
pathways die karakteristiek zijn voor levende organismen
▪ De pathways verantwoordelijk voor synthese en degradatie van
deze moleculen en de mechanismen verantwoordelijk voor de
fouten in deze pathways
▪ De energetica van biologische processen zoals transport over
celmembraan, productie van cellulaire energie, energie omzetting
en uitwisseling van energie tussen verschillende
celcompartimenten en/of met het extracellulair milieu
→ antwoord op hypothese die we stellen
4
, • Doel van biochemische analyse
o Technieken die hierbij aan bod komen omvatten zowel
▪ Staalvoorbereiding
Welke stalen, hoeveel ervan, zuiverheid, oorsprong, …
▪ Zuivering & isolatie van bio-componenten uit dit staal
Moet je bio-component isoleren uit staal of kan je staal zo
gebruiken?
Elke stap is verlies (& evt aanpassing) van materiaal dus je
voert alleen noodzakelijke stappen uit
▪ Identificatie, karakterisatie en evt ook kwantificatie van deze bio-
componenten
o In vitro (eenvoudiger, gemakkelijker om te interpreteren, maar minder
overeenkomst met fysiologische situatie) en in vivo systemen
▪ In vitro: eenvoudiger om deelaspecten te bestuderen,
gemakkelijker interpreteerbaar → elk resultaat dat je in vitro
bekomt moet je valideren met in vivo systeem: is complexer
systeem, dus heeft invloed op experiment
▪ Maar niet meteen in vivo: is heel complex, kostbaar
▪ Eerst veel dingen in vitro uitproberen
DESIGN VAN EEN BIOCHEMISCH EXPERIMENT
• Hoe ontwikkelen van een goed biochemisch experiment?
• Stap 1: wat willen we onderzoeken?
o Kan heel breed zijn: bvb therapeuticum voor borstkanker → kan niet met 1
onderzoek → je verdeelt het onder in kleine onderzoeksvragen
o Identificatie van het onderwerp
o Vb: OZ naar een nieuwe mutatie in het ADNP-eiwit
• Stap 2: wat is er al geweten over dit onderwerp? → literatuurOZ
o Sterktes/zwaktes van de reeds gebruikte methodologieën en
vooropgestelde hypothesen
o Vb: is de mutatie al gekend? Zijn er al andere mutaties gekend in het
ADNP-eiwit? Hoe hebben ze deze onderzocht, welke technieken? Indien
niet: mutaties in andere eiwitten, hoe bestudeerd?
o Kritisch zijn over gepubliceerde papers
▪ Kan zijn dat resultaat eerst verschillende keren mislukt is en ze
enkel de ene keer tonen wanneer het goed was
• Stap 3: welke hypothese willen we testen? Wat is de vraagstelling?
o Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment
gepland werd
5
, o Vb: heeft de gevonden mutatie effect op de lengte van het ADNP-eiwit? →
je wil dus lengte van het eiwit bestuderen
▪ Kon bvb ook functie zijn van eiwit ipv lengte maar dan moet de fct
dus al wel gekend zijn
• Stap 4: welk biologisch systeem gaan we gebruiken?
o Species
o In vitro/in vivo
o Vb: effect van mutatie in humaan systeem dus als je onderzoekt bij mens
zit je dichtst bij vraagstelling
▪ Probleem: ADNP-eiwit komt vnl voor in neuronaal/hersen weefsel
→ moeilijk om aan humane stalen te komen
▪ Transgene muismodellen waarin mutatie aanwezig is? = in vivo
▪ Celculturen van hersencellen waar eiwit in aanwezig is waarin je
het bvb kan overexpresseren voor veel materiaal = in vitro
• Stap 5: welke variabele bestuderen we?
o Hoe zorgen we ervoor dat alle andere parameters stabiel zijn zodat de
gekozen variabele de enige is die de uitkomst van het experiment bepaalt?
o Zijn er andere variabelen buiten degene die we willen bestuderen?
o Identificatie van variabele die bestudeerd wordt + controle van
omgevingsparameters
o Transgene muis vegergelijken met wildtype muis, zelfde ras van muis,
liefst ook muizen van zelfde nestje, indien niet mogelijk wel muizen van
zelfde leeftijd nemen → alle variabelen zo stabiel mogelijk om de variatie
die er sowieso is tussen verschillende individuen zo stabiel mogelijk te
houden
o Vb: te bestuderen variabele = moleculair gewicht van het eiwit
▪ Andere zaken om rekening mee te houden: lading van eiwit, andere
contaminerende eiwitten/moleculen
▪ Hoeveelheid staal nodig
• Stap 6: design van het experiment
o Welke materialen/apparatuur hebben we zelf in labo?
o Welke apparatuur kunnen we gebruiken van andere onderzoeksgroepen?
▪ Of uitbesteding aan bedrijf indien je het zelf echt niet kan doen
o Welke kalibraties hebben we nodig? Welke controles?
o Kostprijs
o Veiligheidsvoorschriften?
o Ethische dossiers, vergunningen, trainingen?
▪ Bvb vergunning ethanol dat we het niet gebruiken om alcohol mee
te maken
6
,• Technieken: hoe kunnen we het moleculair gewicht van een eiwit bepalen?
o Massaspectrometrie
▪ Voordelen:
Zeer gevoelig & nauwkeurig
Zeer exacte bepaling van het moleculair gewicht
▪ Nadelen:
Duur
Tijdsintensief
Zeer dure toestellen → niet in elk labo aanwezig
Lange training → werk uitbesteden
Biologisch staal moet gezuiverd worden van andere
contaminerende eiwitten (anders voor elke bio-component
erin een moleculair gewicht)
o Analytische gelfiltratie chromatografie
▪ Voordelen:
Methode gevoelig genoeg om het moleculair gewicht
nauwkeurig te bepalen (mits goede kalibratie van de kolom)
– Eerst eiwitten op kolom scheiden waarvan je
moleculair gewicht exact kent
Biologisch staal moet niet gezuiverd worden van andere
contaminerende eiwitten
– Want hebben verschillende moleculaire gewichten
en je scheidt eiwitten obv moleculair gewicht
▪ Nadelen:
HLPC toestel nodig (duur + training)
Hoe kan ik het ADNP-eiwit detecteren? → analytische test
aan koppelen
– Je kan niet zeker zeggen dat eiwit met bep moleculair
gewicht het ADNP-eiwit is
o SDS-PAGE en Western blotting
▪ Voordelen:
Methode gevoelig genoeg om moleculair gewicht te bepalen
Biologisch staal moet niet gezuiverd worden van
contaminerende eiwitten
Eenvoudig uit te voeren
Relatief goedkope techniek met standaard labomateriaal
▪ Nadelen:
Er moet een kwalitatief antilichaam tegen ADNP
beschikbaar zijn
→ Wij kiezen SDS-PAGE en Western blotting
7
,• Stap 7: uitvoering van het experiment
o Nauwkeurig, reproduceerbaar
o Kritisch voor uitvoering en handelingen
o Met inbegrip van passende kalibraties & controles
o Elke stap nauwkeurig uitvoeren volgens de opgezochte protocollen
o Positieve controle (= staal dat zeker WT ADNP bevat) en negatieve
controle toepassen
▪ Pos controle moet signaal geven, anders is er iets fout met
experiment
▪ Neg controle is deel van experiment waarvan je geen signaal
verwacht → als je wel signaal krijgt, is het aspecifiek signaal (zeker
als je met antilichamen werkt kan dit)
• Stap 8: analyse van de resultaten
o Kritisch voor bekomen resultaten
o Statistische testen nodig?
▪ Soms hangt # meegenomen stalen af van statistische test die je
toepast
o Vb resultaat
▪ WT heeft lengte van ong 150 kD
▪ Mutante eiwit heeft lengte van rond 75 kD
Groot verschil in moleculair gewicht
▪ Bovenaan heel licht bandje thv WT, dus zelfs in mutante vorm komt
lage c van WT nog tot expressie
• Stap 9: wat kunnen we besluiten uit de resultaten?
o Herhaling nodig? Extra experimenten nodig? Terugkoppeling
vraagstelling?
▪ Je kan nooit iets publiceren dat je maar 1x doet, minstens 1x
herhaling
o Vb: moleculair gewicht van eiwit is ong 75kD lager dan dat van WT eiwit
• Stap 10: nieuwe hypothesen / toekomstige experimenten
o Vloeit voort uit studie
o Opnieuw naar stap 3 van formulering van vraagstelling/hypothese
8
, • Enkele belangrijke opmerkingen
o Notities nemen doorheen het hele proces!
o Controles: steeds meenemen, anders is het experiment waardeloos!
▪ Pos controle: nagaan of het testsysteem werkt
Belangrijk wanneer resultaat neg is
Soms zoek je neg antwoord bvb eiwit dat niet tot expressie
hoort te komen maar je moet weten of dit niet gewoon neg is
omdat de test niet goed werkt
▪ Neg controle: nagaan of het resultaat louter en alleen het gevolg is
van de test (bvb geen contaminatie)
Belangrijk wanneer pos aanwezig is
Bvb dat Al niet aspecifiek bindt
▪ Andere controles: bvb op parameters die moeilijk gelijk te houden
zijn, vergelijking met andere stalen, voor normalisatie (bvb met een
zelfde experiment dat wordt uitgevoerd op ander tijdstip), enz
MEETEENHEDEN
• SI Units (Système Internationale d’Unités): algemeen aanvaarde eenheden,
kunnen worden geconverteerd naar andere units of door conversie uit andere
units verkregen worden
CONCENTRATIES
• Concentratie van een oplossing
o Oplossing = homogeen mengsel van één of meerdere substanties
(solutes) in een vloeibare component (solvent)
o De concentratie van de substanties in de oplossing geeft de hoeveelheid
weer van elke substantie in een bepaalde hoeveelheid solvent (gewicht of
volume)
9
, • Eenheid van concentratie
o Gewoonlijk weight/volume (w/v), soms v/v of w/w (bvb g/l)
▪ Bij w/w moet je rekening houden met dichtheid (bij water 1000 dus
gemakkelijk)
o In percentage waarbij w/v of w/w vermenigvuldigd wordt met 100
▪ w/v: 1% NaCl opl = 1 g NaCl in 100 cm3 of 100 ml water
o Parts per million (ppm) of parts per billion (ppb) (pas op: one billion = 1
miljard), kan uitgedrukt worden in w/v, w/w, w/cm3
o Vb: lucht bevat 8 ppm CO (8 cm3 CO per miljoen cm3 lucht)
▪ 1 g water = equivalent met 1 cm3 dus een substantie van 8 ppm in
water =
8 g in 106 g water (w/w)
8 g in 106 cm3 water (w/cm3)
8 g in 1000 dm3 water
8 mg in 1 dm3 water of 8 mg in 1 l water (w/v)
8 µg in 1 cm3 water of 8 µg in 1 ml water
8 ng in 1 mm3 water
• Mol & molaire massa
o Mol = eenheid voor chemische hoeveelheid
▪ 1 mol = de hoeveelheid van een substantie die 6,022 x 1023
moleculen bevat (getal van Avogrado of NA)
o Molaire massa = massa van 1 mol van een stof
▪ Molaire massa (MW) = de atomaire massa * 1 g/mol dus MW HCl =
36,45 g/mol
• Het begrip molariteit
o Molariteit van een oplossing = mol per liter = # g/molaire massa
3 𝑔/𝑙 𝐻𝐶𝑙
▪ Bvb = 0,08 mol/l of M
36,46 𝑔/𝑚𝑜𝑙
o SI voor concentratie = mol/m3 maar voor biochemische toepassingen:
▪ mol/dm3 = mol/liter = molariteit (M)
o Aangezien biologische substanties gewoonlijk bij relatief lage
concentraties voorkomen en de volumes ook klein zijn, liggen
experimentele oplossingen eerder in het mmol/dm3 (mM), µmol/dm3 (nM)
gebied
o Verdunningen maakt men uit hoger geconcentreerde oplossingen via
formule M1.V1 = M2.V2 met M1 en M2 initiële en finale molariteit en V1 en V2
initieel en finaal volume
o Vb: verdun een stockoplossing van 0,5 mol/l naar 0,025 mol/l met
eindvolume 250 ml
▪ V1 = (M2.V2)/M1
▪ V1 = (0,025 mol/l.0,25 l) / 0,5 mol/l = 0,0125 l stock + 0,2375 l water
10
