GENETISCHE MANIPULATIE V PROEFDIEREN
Permanent:
Niet overerfbaar: somatische gentransfer/gen mutatie
Overerfbaar: geslachtsorganen targetten (zygote injectie/ gene targetting, silencing /
large scale)
Transient: knock down v genexpressie
Overerfbare wijzigingen vh genoom vh organisme: manipulatie v cellen in staat tot
differentiatie naar alle celtypes inclusief de voortplantingscellen ve organisme
Info toevoegen:
o Pronucleus injectie v transgen (zygote injectie)
o Retrovirale gentransfer in embryo’s / lentivirale gentrasfer in zygoten
o Transgen ICSI
Gericht info wijzigen : uitschakelen of muteren
o Homologe recombinatie in embryonale stamcellen
o Zn-finger, CRISPR/Cas technologie
Large scale random mutagenese : bestraling, ENU
Klonen: kern transfer
Transgene dier = bevat vreemd DNA (transgen) geïncorporeerd in genoom v alle
cellen, transgen doorgegeven aan de nakomelingen want ook in geslachtscellen
àcellen = zygote (zygote inj/nuclear transfer/transgen ICSI) + ES-cellen en spermatogoniale
cellen (gene-targetting) + zaadcellen (large scale/transgenICSI) + iPSCs (gene targetting /
overexpressie)
ZYGOTE INJECTIE:
= informatie toevoegen + overerfbaar: injectie v transgen in ½ pronucleusen vd
zygote
Gain of function:
Overexpressie ve transgen (constitutief, induceerbaar, weefselspecifiek)
Wnnr? Aandoening veroorzaakt door teveel expressie / om model te versnellen
Loss of function:
Antisense mRNA coderend transgen / RNAi / CRISPRcas / overexpressie dominant
negatieve genproducten / celablatie
1
, Wnnr ? aandoening door tekort aan expressie / om effect v afwezigheid eiwit te
bestuderen
PROCEDURE ZYGOOT INJECTIE:
1. gezuiverd, gelineariseerd DNA construct:
Promotor (CMV) = stuurt genexpressie aan, zorgt voor start transcriptie
o constitutief, induceerbaar, weefselspecifek
Coderende sequentie = vaak cDNA : korter, bevat geen intronen meer, enkel
coding seq
Terminatie signaal = polyAsignaal :sign dat RNA-pol moet stoppen + zorgt dat
polyA staart wordt gevormd aan mRNA voor stabiliteit
(intronen : soms nodig voor correcte expressie)
(Insulatoren; boundary elements: beschermt gen tegen invloed v omliggende genen)
Rol vd promotor: reguleert expressie ve gen
Wnnr is promotor actief? Embryonaal – adult
In welke cellen is die actief? Weefselspecifieke promotoren
Hoe sterk is de promotor? Bv CMV promotor erg actief!
Gebruik maken v reporteiwitten à kijken als promotor actief is en gen tot expressie komt!
(GFP/luciferase)
Kloneren in bacterieel plasmide: tot 20kb fragmenten, stuk DNA v bacterie waarin gene
of interest inkomt, transformeren in bacterie en die laten opgroeien; hierbij ook
vermenigvuldigen v plasmide en opzuiveren
Alternatieven: artificeel chromosoom (BAC / YAC voor grotere transcripten in te brengen en
dus event genen)
2. injectie in grootste pronucleus vd zygoot (mannelijke) met micromanipulator
3. Implantatie in eileider (trechter) v pseudo-zwangere vrouwtjes (15-22 embryo’s
per vrouwtje)
Embryo-donoren: superovulatie v donor vrouwtjes (meer eicellen, betere koppeling)
Injecteren met 2 hormonen: superovulatie
Tot 40eicellen ipv 10tal eicellen per vrouwtje
Vervolgens koppelen met mannetje want bevruchte eicel nodig
o Enkel koppelen indien vrouwtje in juiste fase v cyclus (cylus = 5d)
o Checken v koppeling indien copulatieplug aan vagina ontstaat + eicellen eruit
halen
2
,Pseudo-zwangere dragermoeders; krijgen geen hormonen : moet hormonaal+fysiolog in
juiste fase zijn
Bevruchte eicellen injecteren met DNA en dan incuberen tot 2cel stadium + in
draagmoeder steken
Vrouwtje moet in juiste fase zijn + niet drachtig + koppelen met gevasectomeerd
mannetje
o Mannetje zaadleider doorgesneden, enkel koppelen indien in juiste fase v
cyclus
o Nog steeds koppelen maar geen zaadcel transmissie: indien koppelen = vrouw
juiste fase
Implantatie in vrouwtje thv trechter; hier opening aan eileider en zo cellen
binnenbrengen
Ongeveer 20 dagen later nieuwe muisjes
4. injectie-nakomelingen = 15-20% positief (founders) : integratie vh transgen op
1of meerdere plaatsen 5. identificatie vd founders = genotypering
Verificatie v transgen integratie = genotypering: DNA niveau
PCR : reverse en forward primer tegen transgen, indien aanwezig wordt het
geamplificeerd
o Specifieke primers: vaak tegen promotor want specifiek voor transcript
Southern blotting: DNA scheiden op gel, fluoresc probes complementair aan
transgen voor detectie
o Aantal kopieen, fragmentgrootte
Genoom sequencing : exacte integratiesite
Controle v correcte expressie: (checken als promotor actief is)
RNA niveau: expressive transgen
o Kwantitatieve reverse transcriptie PCR : mRNA à cDNA à PCR
vermenigvuldiging
o Northern blotting
o In situ hybdridisatie : visuele detectie (gelabelde probes) : ruimtelijke
informatie
Eiwit niveau: productie eiwit
o ELISA : plaat met Ab die specifiek bind aan eiwit + staal toevoegen
o Western blotting met Ab: scheiden, membraan, specifiek Ab tegen eiwit
interesse
o Immunohistochemie/ fluorescentie : weefsel + Ab detectie: ruimtelijke
informatie
Bij DNA oorsnip of staart snip nemen want DNA overal aanwezig in elke cel, bij RNA rekening
houden met weefselspecifieke promotor, het DNA zal niet in elke cel afgeschreven worden
3
, Analyse vh fenotype of gebruik: afhankelijk vh doel vh project
6. founders à kolonie :
founders (F0: 1ste generatie met transgen) gekruist met wildtype
o integratie is willekeurig: zo dus 1st nagaan als het in kiembaan is + stabiel tot
experssie
genotyperen van het F1 nakomelingen : analyse op DNA,RNA, eiwit niveau en
fenotypering
F1 om kolonie op te bouwen: ofwel met WT kruisen (heterozyg lijnen) ofwel met
F1 (25%homoz)
ALGEMEEN ZYGOTE INJECTIE
Voordelen:
Snel + relatief eenvoudig DNA construct
v DNA rechtstreeks naar dier (tijdsduur vd dracht vd diersoort is tijdsbepalend)
Nadelen: niet gecontroleerde integratie in genoom
Qua plaats: willekeurig
o Kan expressie van ander gen onderbreken = insertionele mutatie
o Plaats kan invloed hebben op expressie vh transgen
Qua tijd: mosaicisme indien na 1ste celdeling
o Indien in 2cellig stadium injecteren, uiteindelijk helft vd cellen v organisme
met transcript
o Nrml 50% vd nakomeling positief want ½ kans op doorgeven want ½
allelen met transcript
o Nu gwn minder dan 50%, pak positieve nakomeling en dan kan je gwn nrml
verderdoen
o Je bent niet zeker als het in de kiembaan zit : niet elke founder zal transgen
doorgeven
o Extra generaties nodig om stabiele lijnen op te bouwen
Qua wijze: single copy, maar meestal tandemcopies (meerdere achterelkaar)
o Vaak meerdere kopieen transgen achterelkaar ingebouwd ; in tandem
o Zorgt voor hogere expressie maar vaak onstabiel en verlies v expressie
Liefst werken met heterozygote muizen want indien door insertie gen
uitgeschakeld wordt gaat in homozygote versie dit eiwit helemaal niet meer
gemaakt worden, maar voordeel v homozygoot is hogere expressie
4
Permanent:
Niet overerfbaar: somatische gentransfer/gen mutatie
Overerfbaar: geslachtsorganen targetten (zygote injectie/ gene targetting, silencing /
large scale)
Transient: knock down v genexpressie
Overerfbare wijzigingen vh genoom vh organisme: manipulatie v cellen in staat tot
differentiatie naar alle celtypes inclusief de voortplantingscellen ve organisme
Info toevoegen:
o Pronucleus injectie v transgen (zygote injectie)
o Retrovirale gentransfer in embryo’s / lentivirale gentrasfer in zygoten
o Transgen ICSI
Gericht info wijzigen : uitschakelen of muteren
o Homologe recombinatie in embryonale stamcellen
o Zn-finger, CRISPR/Cas technologie
Large scale random mutagenese : bestraling, ENU
Klonen: kern transfer
Transgene dier = bevat vreemd DNA (transgen) geïncorporeerd in genoom v alle
cellen, transgen doorgegeven aan de nakomelingen want ook in geslachtscellen
àcellen = zygote (zygote inj/nuclear transfer/transgen ICSI) + ES-cellen en spermatogoniale
cellen (gene-targetting) + zaadcellen (large scale/transgenICSI) + iPSCs (gene targetting /
overexpressie)
ZYGOTE INJECTIE:
= informatie toevoegen + overerfbaar: injectie v transgen in ½ pronucleusen vd
zygote
Gain of function:
Overexpressie ve transgen (constitutief, induceerbaar, weefselspecifiek)
Wnnr? Aandoening veroorzaakt door teveel expressie / om model te versnellen
Loss of function:
Antisense mRNA coderend transgen / RNAi / CRISPRcas / overexpressie dominant
negatieve genproducten / celablatie
1
, Wnnr ? aandoening door tekort aan expressie / om effect v afwezigheid eiwit te
bestuderen
PROCEDURE ZYGOOT INJECTIE:
1. gezuiverd, gelineariseerd DNA construct:
Promotor (CMV) = stuurt genexpressie aan, zorgt voor start transcriptie
o constitutief, induceerbaar, weefselspecifek
Coderende sequentie = vaak cDNA : korter, bevat geen intronen meer, enkel
coding seq
Terminatie signaal = polyAsignaal :sign dat RNA-pol moet stoppen + zorgt dat
polyA staart wordt gevormd aan mRNA voor stabiliteit
(intronen : soms nodig voor correcte expressie)
(Insulatoren; boundary elements: beschermt gen tegen invloed v omliggende genen)
Rol vd promotor: reguleert expressie ve gen
Wnnr is promotor actief? Embryonaal – adult
In welke cellen is die actief? Weefselspecifieke promotoren
Hoe sterk is de promotor? Bv CMV promotor erg actief!
Gebruik maken v reporteiwitten à kijken als promotor actief is en gen tot expressie komt!
(GFP/luciferase)
Kloneren in bacterieel plasmide: tot 20kb fragmenten, stuk DNA v bacterie waarin gene
of interest inkomt, transformeren in bacterie en die laten opgroeien; hierbij ook
vermenigvuldigen v plasmide en opzuiveren
Alternatieven: artificeel chromosoom (BAC / YAC voor grotere transcripten in te brengen en
dus event genen)
2. injectie in grootste pronucleus vd zygoot (mannelijke) met micromanipulator
3. Implantatie in eileider (trechter) v pseudo-zwangere vrouwtjes (15-22 embryo’s
per vrouwtje)
Embryo-donoren: superovulatie v donor vrouwtjes (meer eicellen, betere koppeling)
Injecteren met 2 hormonen: superovulatie
Tot 40eicellen ipv 10tal eicellen per vrouwtje
Vervolgens koppelen met mannetje want bevruchte eicel nodig
o Enkel koppelen indien vrouwtje in juiste fase v cyclus (cylus = 5d)
o Checken v koppeling indien copulatieplug aan vagina ontstaat + eicellen eruit
halen
2
,Pseudo-zwangere dragermoeders; krijgen geen hormonen : moet hormonaal+fysiolog in
juiste fase zijn
Bevruchte eicellen injecteren met DNA en dan incuberen tot 2cel stadium + in
draagmoeder steken
Vrouwtje moet in juiste fase zijn + niet drachtig + koppelen met gevasectomeerd
mannetje
o Mannetje zaadleider doorgesneden, enkel koppelen indien in juiste fase v
cyclus
o Nog steeds koppelen maar geen zaadcel transmissie: indien koppelen = vrouw
juiste fase
Implantatie in vrouwtje thv trechter; hier opening aan eileider en zo cellen
binnenbrengen
Ongeveer 20 dagen later nieuwe muisjes
4. injectie-nakomelingen = 15-20% positief (founders) : integratie vh transgen op
1of meerdere plaatsen 5. identificatie vd founders = genotypering
Verificatie v transgen integratie = genotypering: DNA niveau
PCR : reverse en forward primer tegen transgen, indien aanwezig wordt het
geamplificeerd
o Specifieke primers: vaak tegen promotor want specifiek voor transcript
Southern blotting: DNA scheiden op gel, fluoresc probes complementair aan
transgen voor detectie
o Aantal kopieen, fragmentgrootte
Genoom sequencing : exacte integratiesite
Controle v correcte expressie: (checken als promotor actief is)
RNA niveau: expressive transgen
o Kwantitatieve reverse transcriptie PCR : mRNA à cDNA à PCR
vermenigvuldiging
o Northern blotting
o In situ hybdridisatie : visuele detectie (gelabelde probes) : ruimtelijke
informatie
Eiwit niveau: productie eiwit
o ELISA : plaat met Ab die specifiek bind aan eiwit + staal toevoegen
o Western blotting met Ab: scheiden, membraan, specifiek Ab tegen eiwit
interesse
o Immunohistochemie/ fluorescentie : weefsel + Ab detectie: ruimtelijke
informatie
Bij DNA oorsnip of staart snip nemen want DNA overal aanwezig in elke cel, bij RNA rekening
houden met weefselspecifieke promotor, het DNA zal niet in elke cel afgeschreven worden
3
, Analyse vh fenotype of gebruik: afhankelijk vh doel vh project
6. founders à kolonie :
founders (F0: 1ste generatie met transgen) gekruist met wildtype
o integratie is willekeurig: zo dus 1st nagaan als het in kiembaan is + stabiel tot
experssie
genotyperen van het F1 nakomelingen : analyse op DNA,RNA, eiwit niveau en
fenotypering
F1 om kolonie op te bouwen: ofwel met WT kruisen (heterozyg lijnen) ofwel met
F1 (25%homoz)
ALGEMEEN ZYGOTE INJECTIE
Voordelen:
Snel + relatief eenvoudig DNA construct
v DNA rechtstreeks naar dier (tijdsduur vd dracht vd diersoort is tijdsbepalend)
Nadelen: niet gecontroleerde integratie in genoom
Qua plaats: willekeurig
o Kan expressie van ander gen onderbreken = insertionele mutatie
o Plaats kan invloed hebben op expressie vh transgen
Qua tijd: mosaicisme indien na 1ste celdeling
o Indien in 2cellig stadium injecteren, uiteindelijk helft vd cellen v organisme
met transcript
o Nrml 50% vd nakomeling positief want ½ kans op doorgeven want ½
allelen met transcript
o Nu gwn minder dan 50%, pak positieve nakomeling en dan kan je gwn nrml
verderdoen
o Je bent niet zeker als het in de kiembaan zit : niet elke founder zal transgen
doorgeven
o Extra generaties nodig om stabiele lijnen op te bouwen
Qua wijze: single copy, maar meestal tandemcopies (meerdere achterelkaar)
o Vaak meerdere kopieen transgen achterelkaar ingebouwd ; in tandem
o Zorgt voor hogere expressie maar vaak onstabiel en verlies v expressie
Liefst werken met heterozygote muizen want indien door insertie gen
uitgeschakeld wordt gaat in homozygote versie dit eiwit helemaal niet meer
gemaakt worden, maar voordeel v homozygoot is hogere expressie
4
