Samenvatting MoBi deel methode

Kloneren’ van genen
 Stuk DNA isoleren en in zuivere toestand
aanraken
o Stuk DNA waar je geïnteresseerd in bent

 Probleem -> DNA mens is heel groot
o Daarom stukken DNA gebruiken

 Toepassingen
o Voor aanmaak menselijke stoffen zoals
insuline
 1982 recombinant humaan insuline gemaakt
 Bacterieen humaan eiwit aanmaken -> makkelijk op te zuiveren
 Vroeger insuline uit dieren gehaald -> vaak besmet

 Recombinante eiwitten in bacteriën aanmaken
o Kan niet alles laten namaken
o Je moet eiwitten dan injecteren

 Gentherapie
o Zelf eiwitten laten aanmaken
o Genen in menselijke cellen inbrengen

 Kloneren
o Individuele DNA-molecule in autonoom replicerende vector steken
 Vector in gastheercel onafhankelijk van gastheercel genoom kan
repliceren
 Vorming van recombinant -> combinatie van DNA-molecule uit
labo

 Kloon
o Recombinant DNA in gastheercel gebracht
 Recombinant DNA-molecule gaat dan delen

 Kloneren via plasmiden (focussen wij op)

,Plasmiden als vectoren
 Plasmiden die in labo’s zijn gemaakt
o Basiseigenschappen wel zelfde
 Bouw
o ORI -> begin replicatie
o Ampr
 Code voor eiwit dat cellen resistent maakt voor ampicilline
 Bevat code dat resistentiegen gaat aanmaken en ampicilline
kapot maakt
o Resistentiegenen  eiwit met enzymatische functie
 Bv. beta lactamase
o Polylinker/ multity cloningsite (MS)
 Verschillend met normale plasmiden
 Hier kan je vreemd DNA makkelijk invoegen
 Bevat herkenningsplaatsen waar restrictie-enzymen kunnen knippen
 Restrictie-enzymen knippen plaats specifiek
o Kan zo vector openknippen en
vreemd DNA toevoegen
o Shuttle vector
 onderdelen
 Bacteriële ORI en eukaryoten ORI
o Kan in beide organisme repliceren
 Waarom???
 Promoter (blauw)
o Van eukaryoten
 Terminator (paars)
o Poly-A staart enkel bij eukaryoten
 MCS en selectieve genen
o MCS vreemd DNA toe te voegen
o selectie gen
 om cellen die plasmiden opnemen resistent
maken aan producten
 resistentiegen
o bevoordeeld ampr
 functies
o eukaryoten
 Componenten replicatie transcriptie en translatie
o prokaryoten
 Componenten voor replicatie
o Zorgen dat componenten voor replicatie/translatie/transcriptie aanwezig
zijn
o Reden en stappen
 Plasmiden repliceren in prokaryoten
 Grote hoeveel plasmiden DNA wordt aangemaakt  snel en
goedkoop

,  Plasmiden uit prokaryoten halen en inbrengen in eukaryoten
o Proberen gekloneerd gen tot expressie brengen
 Cellen bv. HEK293T  makkelijk vectoren ingebracht en veel
eiwitten maken