Examen ECMB2 - Samenvatting
Algemeen:
Genoom = alle DNA in organisme, inclusief genen.
Genomics = studie van gehele genoom van een organisme; onderzoek naar genen en hun functie.
Transcriptoom = mRNA expressie patroon in een cel of celpopulatie.
Transcriptomics = studie van de genexpressie patronen op mRNA niveau op grote schaal.
Proteoom = eiwit expressie patroon in een cel of celpopulatie.
Proteomics = studie van de genexpressie patroon op eiwit niveau op grote schaal.
Sigle-nucleotide polymor smes: variaties van 1 nucleotide in het genoom, binnen een bepaalde
species —> om de 100-300 nucleotide; gelinkt aan verhoogde vatbaarheid voor bepaalde ziektes
Doelstelling HGP: Medische toepassingen HGP:
- Bepaling volledige DNA sequentie - Oorzak achterhalen genetisch bepaalde
- Identi catie van alle genen ziektes
- Ontwikkelen snellere en e ciëntere - Diagnose
sequeneringsmethodes - Detectie van predispositie voor bepaalde
- E ciënt opslagen/stockeren van alle informatie ziektes
- Ontwikkelen methodes voor e ciënte data analyse - Drug design
- Discussie van ethische, sociale en juridische aspecten. - Gen therapie
mRNA:
Genexpressie wordt vaak op mRNA niveau gemeten omdat het maken van probes eenvoudiger is
dan produceren van speci eke antilichamen, sequencing van nucleïnezuren is eenvoudiger dan
eiwitsequencing en analyse van cellulaire concentraties, synthese en afbraak van mRNA dragen
bij tot onderzoek naar de regulatie van eiwitniveaus.
Next generation sequencing = high-throughput sequencing: DNA en RNA zeer e ciënt en op
relatief korte tijd sequeneren.
Door alternatieve splicing kan van 1 gen meerdere mRNA’s bekomen worden. Door proteolyse
kan van 1 mRNA precursor meerdere eiwitten bekomen worden. Door post-translationele
modi caties kunnen eiwitten meerdere functies hebben.
Covalente modi caties: maken van sterke, stabiele bindingen door delen van elektronen tussen
atomen —> blijvend en signi cante invloed op structuur en functie van eiwit.
Niet-covalente modi caties: zwakkere, tijdelijke interacties zoals H-bruggen en ionische bindingen
—> reversibel en dynamisch waardoor ze zorgen voor tijdelijke regulatie van eiwitfunctie.
mRNA / genexpressie pro ling: op grote schaal meten van expressie van heel veel mRNAs tegelijk
Extractie van mRNA uit cellen:
1. Celmembraan oplossen adhv detergentia (SDS, triton X-100, sarcosyl)
—> am fatische moleculen die gaan zorgen voor vorming van micellen
2. Afbraak vrijgestelde RNA door endogene RNAses voorkomen adhv lysisbu er
—> guanine thiocyanaat (denaturerende reagentia) verbreekt H-bruggen van eiwit
—> beta-mercapto-ethanol reduceert S-bruggen in eiwit waardoor 3D structuur verloren gaat
3. RNA van eiwitten en DNA scheiden
—> CsCl gradiënt centrifugatie: scheiden obv dichtheid; cellysaat aanbrengen op CsCl
gradiënt met toenemende dichtheid => RNA onderaan (verouderde methode; giftig en lang)
—> Fenol/chloroform extractie onder zure omstandigheden: centrifugatie hiermee zorgt voor
de scheiding in een waterige fase=mekhin1704
4. (bevat RNA), interfase (bevat DNA) en organische fase (bevat fenol, chloroform, eiwitten).
—> Trizol: commercieel verkrijgbaar; isolatie totaal RNA uit cellen; combineert vorige 3
stappen samen en bevat fenol voor scheiding.
5. Precipiteren van RNA adhv 70% ethanol of isopropanol
6. Zuivering mRNA uit totaal RNA adhv polka staart van eukaryotisch mRNA
—> Poly(dT) a niteitschromatogra e: sepharose bolletjes gekoppeld aan oligo dTs
—> Poly(dT) MACS: magnetische bolletjes gekoppeld aan oligo dTs
1
ffi fifi fi ffifi fi fiffi
fifi fi ffi fi ff ffi
,Genexpressie bepalen adhv aanwezigheid van mRNA of eiwit in de cel.
Probe = een gede nieerd RNA of DNA fragment dat radioactief of chemisch gelabeld is dat
gebruikt wordt voor de detectie van speci eke nucleïnezuur sequenties door hybridisatie.
—> hebben gekende sequentie en hybridiseren met een complementaire sequentie.
Labellingsmethoden:
- Radioactiviteit: met radioactieve nucleotide (ATP, CTP) of radioisotopen (32P, 35S, 3H).
Detectie via autoradiogra e (lichtgevoelige lm); oudste methode; strenge veiligheids-
voorschriften en duurder door streng afvalbeleid.
Bij labellen van dNTPs met isotopen wordt de alfa-fosfaatgroep gelabeld. 32P heeft de hoogste
energie en is dus goed detecteerbaar; laagste resolutie —> minder scherpe bandjes.
- Fluorochroom (direct): met uoresceïne of FITC; FISH = uorescent in situ hybridization.
- Enzymen (indirect): met peroxidases of alkalische fosfatases; zetten substraat om naar kleur.
—> toepassing bij enhanced chemoluminiscentie (ECL) = productie licht door een chemische
reactie waarbij er een omzetting gebeurt door horseradish perioxidase.
- Andere: biotine en digoxigenine; biotine kan gebonden worden aan een nucleotide; wordt
herkent door streptavidine dat gebonden kan zijn aan een enzym of uorochroom.
Synthese DNA probes:
- Random priming: benodigdheden: cDNA template, Klenow fragment van DNA polymerase,
dNTPs (waarvan 1 gelabeld), primers (random hexameren). De primers gaan op random
plaatsen binden aan de template waarna het Klenow-fragment de nieuwe DNA streng gaat
synthetiseren startende aan deze primers. De gelabelde nucleotiden worden hierbij ingebouwd.
- Nick translation: benodigdheden: cDNA template, DNAse I, dNTPs (1 gelabeld), DNA polym I.
DNAse I maakt willekeurige nicks in de DNA streng waarna het gat wordt opgevuld door de
gelabelde nucleotide door DNA polymerase I. De volgende dNTPs worden ook 1 voor 1
weggehaald en vervangen door een nieuwe nucleotide.
- End-labelling:
- 5’ end-labeling: behandeling met alkaline fosfatase verwijdert de 5’ fosfaatgroep van de DNA
streng. Daarna opnieuw fosforylatie v. 5’ einde door polynucleotide kinase die een gelabelde
gamma-fosfaatgroep inbouwt van ATP.
- 3’ end-labeling: terminaal transferase kan alfa gelabelde nucleotide inbouwen aan het 3’ einde
Synthese RNA probes:
- Transcriptie labelling: benodigdheden: plasmide met cDNA insert, gelineariseerd plasmide voor
transcriptie labelling, NTPs (1 gelabeld) en RNA polymerase (SP6, T7).
RNA polymerase herkent zijn promotors in de plasmide en begint RNA te synthetiseren waarbij
gelabelde nucleotiden worden ingebouwd. DNAse wordt toegevoegd om de DNA template af te
breken en proteïnase K om de eiwitten te verwijderen.
Tm is de temperatuur waarbij 50% van de strengen zijn gedenatureerd. Deze hangt af van de
hoeveelheid kationen, %GC, lengte van de probe.
—> tussen G en C’s zijn er 3 H-bruggen ipv 2 en kationen stabiliseren de negatieve ladingen van
de fosfaatgroepen in de ruggengraat van de streng.
Hoeveelheid formatie verlaagt de Tm waardoor de strengen bij een lagere temp denatureren.
Soort probe is bepalend voor speci citeit en gevoeligheid van de mRNA detectie methode.
Full cDNA template heeft sterk signaal met zo veel mogelijk gelabelde nucleotides ingebouwd.
Oligo’s worden gebruikt voor het speci ek detecteren van 1 type mRNA molecule.
—> nadeel: maar 1 nucleotide is gelabeld dus minder gevoelig.
Regels voor primers:
- 2 primers; binden elk aan 1 van de 2 DNA strengen
- Lengte: 18-24 nucleotiden
- Verschil in Tm waarde tussen beiden mag max 5°C zijn want we kiezen maar 1 annealing temp
- Afstand tussen primers: 100-1000 nucleotiden (= lengte amplicon)
- Primers mogen niet complementair zijn aan elkaar of zichzelf want vormen dimeren of haripin
- Primers mogen niet complementair zijn aan andere genen
- Voor RT-PCR: primers moeten binden aan cDNA van verschillende exonen om onderscheid te
maken tussen het cDNA en het niet-gewenst genomisch DNA.
2
fi fi fl fi fi fi fi fl fl
, Bij een PCR gaat de concentratie van het amplicon op een bepaald punt een plateau bereikt
doordat Taqman polymerase uitgeput geraakt. Als je start met meer startmateriaal, ga je sneller
een plateau bereiken. MAAR hoe meer startmateriaal, hoe minder cycli nodig.
—> alles onder threshold wordt gezien als ruis
Ct-waarde = cyclus waarbij een signi cante toename in uorescentie waarneembaar is; punt waar
threshold overschreden wordt.
Bij 100% e ciëntie wordt de hoeveelheid DNA bij elke cyclus verdubbeld. Verschil in Ct waarde
tussen 2 stalen duidt op een verschil van factor 2 in hoeveelheid startmateriaal.
2 methodes voor kwanti catie van de resultaten:
- Absolute standaardcurve: standaardcurve RNA/cDNA met gekend aantal kopieën van speci ek
RNA/cDNA => absoluut; standaardcurve met gekende hoeveelheid input RNA/cDNA => relatief.
—> nadelen: e ciëntie v RT niet altijd dezelfde; maken van curve is tijdrovend; HHG komt niet
altijd even sterk tot uitdrukking => wordt altijd boven comparatieve Ct gekozen.
- Comparatieve Ct methode: relateert verschil in Ct waarde tussen 2 stalen aan het verschil in Ct
waarden en HHG —> geen standaardcurve gemaakt; veronderstelling van 100% e ciëntie.
—> e ciëntie van PCR niet altijd dezelfde; HHG komt niet altijd even sterk tot uitdrukking.
Huishoudgen = gen dat altijd aanwezig is in cel omdat de cel dit nodig heeft bv b-actine, tubuline.
—> hvlh HHG is steeds dezelfde en wijzigt niet oiv een bepaalde stimulus.
=> meegenomen om te normaliseren tov de input
MRD = opsporen van tumorcellen obv tumorspeci eke DNA sequenties of mRNA transcripten.
—> bepaling hoeveel tumorcellen er na een behandeling nog overblijven.
Philadelphia chromosoom: translocatie tussen chromo 22 en 9 => BCR/ABL fusiegen met
ontregelde tyrosine kinase activiteit; chronische melodie leukemie
—> behandeling met een tyrosine kinase inhibitor
Dit is kenmerk van kankercellen en kunnen hiermee onderscheiden worden van gezonde cellen.
Kan daarna MRD berekenen adhv realtime PCR voor BCR/ABL fusiegen en albumine als HHG.
Detectie van kleine mutaties:
- Ampli cation-refractory mutation system (ARMS): remming van ampli catie in aanwezigheid
van eender welke puntmutatie of deletie; sequentie-speci eke PCR primers.
—> verschuiving van curve doordat het moment van het bereiken van de Ct waarde hoger ligt.
- Smeltcurve van probe en amplicon: door de mutatie verloopt de binding niet e ciënt en is er
minder energie nodig voor denaturatie waardoor de curve veranderd.
Spotting op microarrays:
- Mechanical: fysieke pinnen om probes op oppervlak te krijgen; minder precies.
- Inkjet: spuitmondjes om probes zonder fysiek contact + hoge precisie op oppervlak te brengen.
—> kristal knijpt samen door elektrische lading waardoor vloeistof vrijkomt.
Hoe blijft cDNA hangen op glazen drager?
- Koppeling obv lading: plaat coaten met polk-lysine dat positief geladen is —> DNA is negatief.
- Covalente koppeling: gebruik maken van dNTPs die een allyl-groep hebben en kunnen binden
aan de aldehydes dat aan het substraat bevestigd zijn => covalente binding.
On-chip synthese door fotolithogra e: op het glas wordt een linker aangebracht die aan het vrije
uiteinde beschermd is zodat geen vrije hydroxylgroepen van de basen kunnen binden. De
chemische modi catie is lichtgevoelig —> bij belichting valt de bescherming weg waardoor de
reactieve hydroxylgroepen vrijkomen en kunnen interageren met NTPs. Door gebruik te maken
van een masker die op bepaalde plaatsen licht doorlaat, kunnen we controleren waar dit gebeurd.
Keuze van de probes bepaalt de gevoeligheid en speci citeit van de microarray:
- Full-length cDNA probes: binden meer cDNAs afkomstig van een bepaald mRNA dan oligo’s.
—> kunnen zeldzame RNAs detecteren; binden ook splice varianten dus minder speci ek.
- Korte oligo’s (25bp): binden minder e ciënt; speci eker voor homologe genen & splice variante
- Langere oligo’s (40-80): goede gevoeligheid met vermogen om splice varianten en homologe
genen te onderscheiden.
3
ffi
fi ffi ffi fi fi fi fiffi fi fifl fi fi ffi ffi fi fi
Algemeen:
Genoom = alle DNA in organisme, inclusief genen.
Genomics = studie van gehele genoom van een organisme; onderzoek naar genen en hun functie.
Transcriptoom = mRNA expressie patroon in een cel of celpopulatie.
Transcriptomics = studie van de genexpressie patronen op mRNA niveau op grote schaal.
Proteoom = eiwit expressie patroon in een cel of celpopulatie.
Proteomics = studie van de genexpressie patroon op eiwit niveau op grote schaal.
Sigle-nucleotide polymor smes: variaties van 1 nucleotide in het genoom, binnen een bepaalde
species —> om de 100-300 nucleotide; gelinkt aan verhoogde vatbaarheid voor bepaalde ziektes
Doelstelling HGP: Medische toepassingen HGP:
- Bepaling volledige DNA sequentie - Oorzak achterhalen genetisch bepaalde
- Identi catie van alle genen ziektes
- Ontwikkelen snellere en e ciëntere - Diagnose
sequeneringsmethodes - Detectie van predispositie voor bepaalde
- E ciënt opslagen/stockeren van alle informatie ziektes
- Ontwikkelen methodes voor e ciënte data analyse - Drug design
- Discussie van ethische, sociale en juridische aspecten. - Gen therapie
mRNA:
Genexpressie wordt vaak op mRNA niveau gemeten omdat het maken van probes eenvoudiger is
dan produceren van speci eke antilichamen, sequencing van nucleïnezuren is eenvoudiger dan
eiwitsequencing en analyse van cellulaire concentraties, synthese en afbraak van mRNA dragen
bij tot onderzoek naar de regulatie van eiwitniveaus.
Next generation sequencing = high-throughput sequencing: DNA en RNA zeer e ciënt en op
relatief korte tijd sequeneren.
Door alternatieve splicing kan van 1 gen meerdere mRNA’s bekomen worden. Door proteolyse
kan van 1 mRNA precursor meerdere eiwitten bekomen worden. Door post-translationele
modi caties kunnen eiwitten meerdere functies hebben.
Covalente modi caties: maken van sterke, stabiele bindingen door delen van elektronen tussen
atomen —> blijvend en signi cante invloed op structuur en functie van eiwit.
Niet-covalente modi caties: zwakkere, tijdelijke interacties zoals H-bruggen en ionische bindingen
—> reversibel en dynamisch waardoor ze zorgen voor tijdelijke regulatie van eiwitfunctie.
mRNA / genexpressie pro ling: op grote schaal meten van expressie van heel veel mRNAs tegelijk
Extractie van mRNA uit cellen:
1. Celmembraan oplossen adhv detergentia (SDS, triton X-100, sarcosyl)
—> am fatische moleculen die gaan zorgen voor vorming van micellen
2. Afbraak vrijgestelde RNA door endogene RNAses voorkomen adhv lysisbu er
—> guanine thiocyanaat (denaturerende reagentia) verbreekt H-bruggen van eiwit
—> beta-mercapto-ethanol reduceert S-bruggen in eiwit waardoor 3D structuur verloren gaat
3. RNA van eiwitten en DNA scheiden
—> CsCl gradiënt centrifugatie: scheiden obv dichtheid; cellysaat aanbrengen op CsCl
gradiënt met toenemende dichtheid => RNA onderaan (verouderde methode; giftig en lang)
—> Fenol/chloroform extractie onder zure omstandigheden: centrifugatie hiermee zorgt voor
de scheiding in een waterige fase=mekhin1704
4. (bevat RNA), interfase (bevat DNA) en organische fase (bevat fenol, chloroform, eiwitten).
—> Trizol: commercieel verkrijgbaar; isolatie totaal RNA uit cellen; combineert vorige 3
stappen samen en bevat fenol voor scheiding.
5. Precipiteren van RNA adhv 70% ethanol of isopropanol
6. Zuivering mRNA uit totaal RNA adhv polka staart van eukaryotisch mRNA
—> Poly(dT) a niteitschromatogra e: sepharose bolletjes gekoppeld aan oligo dTs
—> Poly(dT) MACS: magnetische bolletjes gekoppeld aan oligo dTs
1
ffi fifi fi ffifi fi fiffi
fifi fi ffi fi ff ffi
,Genexpressie bepalen adhv aanwezigheid van mRNA of eiwit in de cel.
Probe = een gede nieerd RNA of DNA fragment dat radioactief of chemisch gelabeld is dat
gebruikt wordt voor de detectie van speci eke nucleïnezuur sequenties door hybridisatie.
—> hebben gekende sequentie en hybridiseren met een complementaire sequentie.
Labellingsmethoden:
- Radioactiviteit: met radioactieve nucleotide (ATP, CTP) of radioisotopen (32P, 35S, 3H).
Detectie via autoradiogra e (lichtgevoelige lm); oudste methode; strenge veiligheids-
voorschriften en duurder door streng afvalbeleid.
Bij labellen van dNTPs met isotopen wordt de alfa-fosfaatgroep gelabeld. 32P heeft de hoogste
energie en is dus goed detecteerbaar; laagste resolutie —> minder scherpe bandjes.
- Fluorochroom (direct): met uoresceïne of FITC; FISH = uorescent in situ hybridization.
- Enzymen (indirect): met peroxidases of alkalische fosfatases; zetten substraat om naar kleur.
—> toepassing bij enhanced chemoluminiscentie (ECL) = productie licht door een chemische
reactie waarbij er een omzetting gebeurt door horseradish perioxidase.
- Andere: biotine en digoxigenine; biotine kan gebonden worden aan een nucleotide; wordt
herkent door streptavidine dat gebonden kan zijn aan een enzym of uorochroom.
Synthese DNA probes:
- Random priming: benodigdheden: cDNA template, Klenow fragment van DNA polymerase,
dNTPs (waarvan 1 gelabeld), primers (random hexameren). De primers gaan op random
plaatsen binden aan de template waarna het Klenow-fragment de nieuwe DNA streng gaat
synthetiseren startende aan deze primers. De gelabelde nucleotiden worden hierbij ingebouwd.
- Nick translation: benodigdheden: cDNA template, DNAse I, dNTPs (1 gelabeld), DNA polym I.
DNAse I maakt willekeurige nicks in de DNA streng waarna het gat wordt opgevuld door de
gelabelde nucleotide door DNA polymerase I. De volgende dNTPs worden ook 1 voor 1
weggehaald en vervangen door een nieuwe nucleotide.
- End-labelling:
- 5’ end-labeling: behandeling met alkaline fosfatase verwijdert de 5’ fosfaatgroep van de DNA
streng. Daarna opnieuw fosforylatie v. 5’ einde door polynucleotide kinase die een gelabelde
gamma-fosfaatgroep inbouwt van ATP.
- 3’ end-labeling: terminaal transferase kan alfa gelabelde nucleotide inbouwen aan het 3’ einde
Synthese RNA probes:
- Transcriptie labelling: benodigdheden: plasmide met cDNA insert, gelineariseerd plasmide voor
transcriptie labelling, NTPs (1 gelabeld) en RNA polymerase (SP6, T7).
RNA polymerase herkent zijn promotors in de plasmide en begint RNA te synthetiseren waarbij
gelabelde nucleotiden worden ingebouwd. DNAse wordt toegevoegd om de DNA template af te
breken en proteïnase K om de eiwitten te verwijderen.
Tm is de temperatuur waarbij 50% van de strengen zijn gedenatureerd. Deze hangt af van de
hoeveelheid kationen, %GC, lengte van de probe.
—> tussen G en C’s zijn er 3 H-bruggen ipv 2 en kationen stabiliseren de negatieve ladingen van
de fosfaatgroepen in de ruggengraat van de streng.
Hoeveelheid formatie verlaagt de Tm waardoor de strengen bij een lagere temp denatureren.
Soort probe is bepalend voor speci citeit en gevoeligheid van de mRNA detectie methode.
Full cDNA template heeft sterk signaal met zo veel mogelijk gelabelde nucleotides ingebouwd.
Oligo’s worden gebruikt voor het speci ek detecteren van 1 type mRNA molecule.
—> nadeel: maar 1 nucleotide is gelabeld dus minder gevoelig.
Regels voor primers:
- 2 primers; binden elk aan 1 van de 2 DNA strengen
- Lengte: 18-24 nucleotiden
- Verschil in Tm waarde tussen beiden mag max 5°C zijn want we kiezen maar 1 annealing temp
- Afstand tussen primers: 100-1000 nucleotiden (= lengte amplicon)
- Primers mogen niet complementair zijn aan elkaar of zichzelf want vormen dimeren of haripin
- Primers mogen niet complementair zijn aan andere genen
- Voor RT-PCR: primers moeten binden aan cDNA van verschillende exonen om onderscheid te
maken tussen het cDNA en het niet-gewenst genomisch DNA.
2
fi fi fl fi fi fi fi fl fl
, Bij een PCR gaat de concentratie van het amplicon op een bepaald punt een plateau bereikt
doordat Taqman polymerase uitgeput geraakt. Als je start met meer startmateriaal, ga je sneller
een plateau bereiken. MAAR hoe meer startmateriaal, hoe minder cycli nodig.
—> alles onder threshold wordt gezien als ruis
Ct-waarde = cyclus waarbij een signi cante toename in uorescentie waarneembaar is; punt waar
threshold overschreden wordt.
Bij 100% e ciëntie wordt de hoeveelheid DNA bij elke cyclus verdubbeld. Verschil in Ct waarde
tussen 2 stalen duidt op een verschil van factor 2 in hoeveelheid startmateriaal.
2 methodes voor kwanti catie van de resultaten:
- Absolute standaardcurve: standaardcurve RNA/cDNA met gekend aantal kopieën van speci ek
RNA/cDNA => absoluut; standaardcurve met gekende hoeveelheid input RNA/cDNA => relatief.
—> nadelen: e ciëntie v RT niet altijd dezelfde; maken van curve is tijdrovend; HHG komt niet
altijd even sterk tot uitdrukking => wordt altijd boven comparatieve Ct gekozen.
- Comparatieve Ct methode: relateert verschil in Ct waarde tussen 2 stalen aan het verschil in Ct
waarden en HHG —> geen standaardcurve gemaakt; veronderstelling van 100% e ciëntie.
—> e ciëntie van PCR niet altijd dezelfde; HHG komt niet altijd even sterk tot uitdrukking.
Huishoudgen = gen dat altijd aanwezig is in cel omdat de cel dit nodig heeft bv b-actine, tubuline.
—> hvlh HHG is steeds dezelfde en wijzigt niet oiv een bepaalde stimulus.
=> meegenomen om te normaliseren tov de input
MRD = opsporen van tumorcellen obv tumorspeci eke DNA sequenties of mRNA transcripten.
—> bepaling hoeveel tumorcellen er na een behandeling nog overblijven.
Philadelphia chromosoom: translocatie tussen chromo 22 en 9 => BCR/ABL fusiegen met
ontregelde tyrosine kinase activiteit; chronische melodie leukemie
—> behandeling met een tyrosine kinase inhibitor
Dit is kenmerk van kankercellen en kunnen hiermee onderscheiden worden van gezonde cellen.
Kan daarna MRD berekenen adhv realtime PCR voor BCR/ABL fusiegen en albumine als HHG.
Detectie van kleine mutaties:
- Ampli cation-refractory mutation system (ARMS): remming van ampli catie in aanwezigheid
van eender welke puntmutatie of deletie; sequentie-speci eke PCR primers.
—> verschuiving van curve doordat het moment van het bereiken van de Ct waarde hoger ligt.
- Smeltcurve van probe en amplicon: door de mutatie verloopt de binding niet e ciënt en is er
minder energie nodig voor denaturatie waardoor de curve veranderd.
Spotting op microarrays:
- Mechanical: fysieke pinnen om probes op oppervlak te krijgen; minder precies.
- Inkjet: spuitmondjes om probes zonder fysiek contact + hoge precisie op oppervlak te brengen.
—> kristal knijpt samen door elektrische lading waardoor vloeistof vrijkomt.
Hoe blijft cDNA hangen op glazen drager?
- Koppeling obv lading: plaat coaten met polk-lysine dat positief geladen is —> DNA is negatief.
- Covalente koppeling: gebruik maken van dNTPs die een allyl-groep hebben en kunnen binden
aan de aldehydes dat aan het substraat bevestigd zijn => covalente binding.
On-chip synthese door fotolithogra e: op het glas wordt een linker aangebracht die aan het vrije
uiteinde beschermd is zodat geen vrije hydroxylgroepen van de basen kunnen binden. De
chemische modi catie is lichtgevoelig —> bij belichting valt de bescherming weg waardoor de
reactieve hydroxylgroepen vrijkomen en kunnen interageren met NTPs. Door gebruik te maken
van een masker die op bepaalde plaatsen licht doorlaat, kunnen we controleren waar dit gebeurd.
Keuze van de probes bepaalt de gevoeligheid en speci citeit van de microarray:
- Full-length cDNA probes: binden meer cDNAs afkomstig van een bepaald mRNA dan oligo’s.
—> kunnen zeldzame RNAs detecteren; binden ook splice varianten dus minder speci ek.
- Korte oligo’s (25bp): binden minder e ciënt; speci eker voor homologe genen & splice variante
- Langere oligo’s (40-80): goede gevoeligheid met vermogen om splice varianten en homologe
genen te onderscheiden.
3
ffi
fi ffi ffi fi fi fi fiffi fi fifl fi fi ffi ffi fi fi
