FA-BA 204 Samenvatting
Week 1
Stappen voor het maken van een therapeutic eiwit
1. Small scale growth
Ontdooien van cellen van de celbank. De cellen worden gemixt met een groeimedium
dat de cellen voedt en ervoor zorgt dat ze kunnen groeien en reproduceren. Iedere
cell produceert een klein beetje van het therapeutic protein en in een paar weken
vermenigvuldigen de cellen zich van een aantal miljoen naar meer dan 30 miljard.
2. Large scale growth
De celpopulatie wordt naar een bioreactor verplaatst dat genoeg plek heeft voor de
cellen om verder te vermenigvuldigen. Wanneer de bioreactor verzadigd raakt,
worden ze naar een grotere verplaatst om nóg verder te groeien. Dit proces herhaalt
zich een aantal keer totdat er genoeg cellen zijn om een bioreactor te vullen waar
duizenden liters in passen.
3. Production and harvest
Wanneer de cellen in de laatste bioreactor zitten, worden ze gevoegd bij het extra
groeimedium om de populatie nog verder te laten groeien zodat ze meer therapeutic
protein er uit halen. De cellen blijven nog wel in de bioreactor. Iedere dag worden er
monsters genomen en getest op de groei en kwaliteit van de cellen.
4. Purification
De oplossing met cellen dat de therapeutic proteins en andere proteins bevat, wordt
gefilterd om vervuiling eruit te halen. Deze filtering ondergaat strenge kwaliteitseisen.
Een behandeling voor een patiënt bevat een aantal milligram van de zuivere eiwitten
5. Fill and finish
De zuivere eiwitoplossing wordt in kleine ampullen verdeeld in een steriele omgeving
zodat er geen contaminatie plaatsvindt en de veiligheid gewaarborgd kan worden.
Sommige behandelingen worden nog gevriesdroogd. Elke ampul wordt hierna
individueel geïnspecteerd voor onzuiverheden en monsters worden geanalyseerd.
Hierna zijn ze klaar om gestickerd en getransporteerd te worden.
Biosimilar betekent het wanneer een biologisch geneesmiddel heel erg overeenkomt met
een al bekend en goedgekeurd geneesmiddel. Ze lijken heel erg op de bestaande structuur,
maar zijn net anders gemodificeerd om meer kosteneffectief te zijn.
Biogenerieke middelen hebben dezelfde moleculaire structuur en zijn vaak nóg goedkoper
dan biosimilars.
Small molecule drugs zijn relatief kleine moleculen (<900 Da) die chemisch
gesynthetiseerd worden in een laboratorium of fabriek en kunnen oraal ingenomen worden.
,Biopharmaceuticals zijn grotere complexe eiwitten (zoals eiwitten, antilichamen of
enzymen) die niet volledig chemisch gesynthetiseerd kan worden, maar met
biotechnologische methoden worden geproduceerd. Vaak met behulp van levende
organismen zoals bacteriën, gisten of zoogdiercellen. Ze worden meestal geïnjecteerd.
DNA, RNA en eiwitten
Het DNA is een dubbelstrengs molecuul dat bestaat uit een template strand en een coding
strand. De DNA sequentie bestaat uit een herhaling van vier basen. Dit zijn: Adenine (A),
Guanine (G), Cytosine (C) en Thymine (T). Hervan is Adenine gebonden aan Thymine met
twee waterstofbruggen en Guanine en Cytosine zijn aan elkaar gekoppeld met drie
waterstofbruggen. Deze binding vindt plaatst tussen de twee strengen van het DNA. Om de
nucleotiden binnen een streng te binden, zijn er fosfodiësters die gelinkt zijn aan een
stikstofbase. Aan de stikstofbase zit een deoxyribose gebonden die de nucleotidesoort
bepaalt.
Wanneer het DNA gekopieerd moet worden, wordt dit gedaan met RNA. Het DNA splitst in
tweeën en het enzym RNA-polymerase bindt aan de 3’ kant van de template strand. Door
de complementaire nucleotide te binden, krijg je zo een kopie van de coding strand. De
transcriptie vindt altijd plaats van 3’ naar 5’. Het enige verschil is dat er geen Thymine bindt
aan de Adenine, maar Uracil (U) en RNA heeft geen deoxyribose, maar ribose als
ruggengraat. Om te weten waar de RNA-polymerase aan moet binden, vormen verschillende
nucleotiden bepaalde aminozuren die kunnen fungeren als start- of stopcodon.
Dit proces van de RNA synthese vindt plaats in de nucleus van de cel. Nadat het RNA
gesynthetiseerd is, kan het eiwit gevormd worden in het cytosol en vervolgens wordt het
eiwit geglycosyleerd in het Endoplasmatisch Reticulum (ER) en in het Golgi-apparaat.
Een prokaryotische cel heeft geen nucleus en dus vindt de synthese van RNA en het eiwit
plaats in het cytoplasma. Waar een eukaryotische cel onderscheid vindt in intronen en
exonen die gespliced worden in de nucleus, is er bij een prokaryotische cel geen splicing en
de glycosylering is gelimiteerd. Deze vindt vaak plaats buiten het plasmamembraan.
, Onderdelen mRNA
Messenger RNA speelt een belangrijke rol in de eiwitsynthese. Het brengt de genetische
code van het DNA naar het ribosoom op het ER om vertaald te worden naar een eiwit. De
sequentie van mRNA staat hieronder:
5’ Cap = Het eerste nucleotide van het mRNA dat ervoor zorgt dat het niet wordt afgebroken,
herkend kan worden door het ribosoom en voor transport uit de nucleus. Prokaryotische
cellen hebben geen 5’ Cap.
5’ UTR = Tussen de 5’ Cap en het startcodon. Reguleert de translatiestart en kan secundaire
structuren bevatten (α-helices en β-sheets) die de binden van het ribosoom beïnvloeden. Ze
kunnen ook regulerende eiwitten binden. Zelf codeert het voor niets.
3’ UTR = Tussen het stopcodon en de poly-A-staart. Codeert ook nergens voor, maar
reguleert de stabiliteit, lokalisatie en levensduur van het mRNA. Ook bevat het
bindingsplaatsen voor miRNA’s om de translatie te remmen.
Poly-A-staart = Beschermt mRNA tegen afbraak van exonucleasen, helpt bij het transport
en kan binden aan de 5’ Cap om een gesloten lus te vormen en de translatie kan weer
makkelijker starten.
Glycosylering
Glycosylering is een vorm van posttranslationele modificaties om de stabiliteit en
oplosbaarheid te verhogen. De N-linked glycosylering vindt plaats in het Endoplasmatisch
Reticulum en het Golgi-apparaat. Enkele excentrieke functies van N-linked glycaanstructuren
is het regelen van transport glycoproteïnen (P-gp) en het bemiddelt bij cel-cel- en cel-matrix-
interacties. Niet alle cellen kunnen glycosyleren. Prokaryotische cellen kunnen niet
glycosyleren, gistcellen een beetje en zoogdiercellen kunnen het goed. Echter, glycosylering
in andere cellen is wel anders en kunnen op deze manier voor een immuunrespons zorgen.
De glycosylering van eukaryoten wordt vaak gedaan in Chinese Hamster Ovary cellen, CHO.
Prokaryoten Kunnen niet glycosyleren Goedkoop en snel
Gistcellen Kunnen beperkt glycosyleren
Eukaryoten Kunnen goed glycosyleren Duur en traag
Week 1
Stappen voor het maken van een therapeutic eiwit
1. Small scale growth
Ontdooien van cellen van de celbank. De cellen worden gemixt met een groeimedium
dat de cellen voedt en ervoor zorgt dat ze kunnen groeien en reproduceren. Iedere
cell produceert een klein beetje van het therapeutic protein en in een paar weken
vermenigvuldigen de cellen zich van een aantal miljoen naar meer dan 30 miljard.
2. Large scale growth
De celpopulatie wordt naar een bioreactor verplaatst dat genoeg plek heeft voor de
cellen om verder te vermenigvuldigen. Wanneer de bioreactor verzadigd raakt,
worden ze naar een grotere verplaatst om nóg verder te groeien. Dit proces herhaalt
zich een aantal keer totdat er genoeg cellen zijn om een bioreactor te vullen waar
duizenden liters in passen.
3. Production and harvest
Wanneer de cellen in de laatste bioreactor zitten, worden ze gevoegd bij het extra
groeimedium om de populatie nog verder te laten groeien zodat ze meer therapeutic
protein er uit halen. De cellen blijven nog wel in de bioreactor. Iedere dag worden er
monsters genomen en getest op de groei en kwaliteit van de cellen.
4. Purification
De oplossing met cellen dat de therapeutic proteins en andere proteins bevat, wordt
gefilterd om vervuiling eruit te halen. Deze filtering ondergaat strenge kwaliteitseisen.
Een behandeling voor een patiënt bevat een aantal milligram van de zuivere eiwitten
5. Fill and finish
De zuivere eiwitoplossing wordt in kleine ampullen verdeeld in een steriele omgeving
zodat er geen contaminatie plaatsvindt en de veiligheid gewaarborgd kan worden.
Sommige behandelingen worden nog gevriesdroogd. Elke ampul wordt hierna
individueel geïnspecteerd voor onzuiverheden en monsters worden geanalyseerd.
Hierna zijn ze klaar om gestickerd en getransporteerd te worden.
Biosimilar betekent het wanneer een biologisch geneesmiddel heel erg overeenkomt met
een al bekend en goedgekeurd geneesmiddel. Ze lijken heel erg op de bestaande structuur,
maar zijn net anders gemodificeerd om meer kosteneffectief te zijn.
Biogenerieke middelen hebben dezelfde moleculaire structuur en zijn vaak nóg goedkoper
dan biosimilars.
Small molecule drugs zijn relatief kleine moleculen (<900 Da) die chemisch
gesynthetiseerd worden in een laboratorium of fabriek en kunnen oraal ingenomen worden.
,Biopharmaceuticals zijn grotere complexe eiwitten (zoals eiwitten, antilichamen of
enzymen) die niet volledig chemisch gesynthetiseerd kan worden, maar met
biotechnologische methoden worden geproduceerd. Vaak met behulp van levende
organismen zoals bacteriën, gisten of zoogdiercellen. Ze worden meestal geïnjecteerd.
DNA, RNA en eiwitten
Het DNA is een dubbelstrengs molecuul dat bestaat uit een template strand en een coding
strand. De DNA sequentie bestaat uit een herhaling van vier basen. Dit zijn: Adenine (A),
Guanine (G), Cytosine (C) en Thymine (T). Hervan is Adenine gebonden aan Thymine met
twee waterstofbruggen en Guanine en Cytosine zijn aan elkaar gekoppeld met drie
waterstofbruggen. Deze binding vindt plaatst tussen de twee strengen van het DNA. Om de
nucleotiden binnen een streng te binden, zijn er fosfodiësters die gelinkt zijn aan een
stikstofbase. Aan de stikstofbase zit een deoxyribose gebonden die de nucleotidesoort
bepaalt.
Wanneer het DNA gekopieerd moet worden, wordt dit gedaan met RNA. Het DNA splitst in
tweeën en het enzym RNA-polymerase bindt aan de 3’ kant van de template strand. Door
de complementaire nucleotide te binden, krijg je zo een kopie van de coding strand. De
transcriptie vindt altijd plaats van 3’ naar 5’. Het enige verschil is dat er geen Thymine bindt
aan de Adenine, maar Uracil (U) en RNA heeft geen deoxyribose, maar ribose als
ruggengraat. Om te weten waar de RNA-polymerase aan moet binden, vormen verschillende
nucleotiden bepaalde aminozuren die kunnen fungeren als start- of stopcodon.
Dit proces van de RNA synthese vindt plaats in de nucleus van de cel. Nadat het RNA
gesynthetiseerd is, kan het eiwit gevormd worden in het cytosol en vervolgens wordt het
eiwit geglycosyleerd in het Endoplasmatisch Reticulum (ER) en in het Golgi-apparaat.
Een prokaryotische cel heeft geen nucleus en dus vindt de synthese van RNA en het eiwit
plaats in het cytoplasma. Waar een eukaryotische cel onderscheid vindt in intronen en
exonen die gespliced worden in de nucleus, is er bij een prokaryotische cel geen splicing en
de glycosylering is gelimiteerd. Deze vindt vaak plaats buiten het plasmamembraan.
, Onderdelen mRNA
Messenger RNA speelt een belangrijke rol in de eiwitsynthese. Het brengt de genetische
code van het DNA naar het ribosoom op het ER om vertaald te worden naar een eiwit. De
sequentie van mRNA staat hieronder:
5’ Cap = Het eerste nucleotide van het mRNA dat ervoor zorgt dat het niet wordt afgebroken,
herkend kan worden door het ribosoom en voor transport uit de nucleus. Prokaryotische
cellen hebben geen 5’ Cap.
5’ UTR = Tussen de 5’ Cap en het startcodon. Reguleert de translatiestart en kan secundaire
structuren bevatten (α-helices en β-sheets) die de binden van het ribosoom beïnvloeden. Ze
kunnen ook regulerende eiwitten binden. Zelf codeert het voor niets.
3’ UTR = Tussen het stopcodon en de poly-A-staart. Codeert ook nergens voor, maar
reguleert de stabiliteit, lokalisatie en levensduur van het mRNA. Ook bevat het
bindingsplaatsen voor miRNA’s om de translatie te remmen.
Poly-A-staart = Beschermt mRNA tegen afbraak van exonucleasen, helpt bij het transport
en kan binden aan de 5’ Cap om een gesloten lus te vormen en de translatie kan weer
makkelijker starten.
Glycosylering
Glycosylering is een vorm van posttranslationele modificaties om de stabiliteit en
oplosbaarheid te verhogen. De N-linked glycosylering vindt plaats in het Endoplasmatisch
Reticulum en het Golgi-apparaat. Enkele excentrieke functies van N-linked glycaanstructuren
is het regelen van transport glycoproteïnen (P-gp) en het bemiddelt bij cel-cel- en cel-matrix-
interacties. Niet alle cellen kunnen glycosyleren. Prokaryotische cellen kunnen niet
glycosyleren, gistcellen een beetje en zoogdiercellen kunnen het goed. Echter, glycosylering
in andere cellen is wel anders en kunnen op deze manier voor een immuunrespons zorgen.
De glycosylering van eukaryoten wordt vaak gedaan in Chinese Hamster Ovary cellen, CHO.
Prokaryoten Kunnen niet glycosyleren Goedkoop en snel
Gistcellen Kunnen beperkt glycosyleren
Eukaryoten Kunnen goed glycosyleren Duur en traag
