Vragen
Hoofdstuk 1: Crispr/Cas
Leg uit hoe je een gen kan editen met Crispr-Cas ahv 2 grote stappen. Je kan het mechanisme van
iedere stap volledig beschrijven.
dsDNA knippen op sequentie-specifieke wijze
1. Eerste onderdeel in CRISPR-Cas systeem: verantwoordelijk voor herkenning van gewenste
DNA-sequentie:
a. sgRNA: een kort RNA fragment bestaande uit 2 onderdelen:
i. Herkenningssequentie aan het te modifiëren gDNA (= CrRNA)
ii. Herkenningssequentie om Cas9 te binden (= tracerRNA)
b. PAM sequentie: Protospacer Adjacent Motif
Sequentie die onmiddelijk stroomafwaarts van de doelsequentie ligt en zodoende
bepaalt waar het DNA gekliefd zal worden.
PAM bepaalt op die manier doelsequentie van gRNA
2. Tweede onderdeel is verantwoordelijk voor sgRNA binding, helicase en nuclease activiteit
a. Cas eiwit: enzyme dat het doelDNA “denatureert” en knipt
Meest populaire Cas enzyme is Cas9 protein
Geeef sleutecomponenten (examenvraag december ’22):
1. Doel of Target DNA: genomische regio die gemodifieerd wordt
2. PAM sequentie: maakt deel uit van doelsequentie en bindt Cas9: kiest waar de knip is
3. gRNA: kort RNA fragment, bindt Cas9 + herkenningssequentie
a. CrRNA: 20nt aan het 5’ uiteinde van gRNA, complementair aan doel DNA: functie:
herkent het doel DNA
b. Transactiverend CRISPR RNA (tracrRNA): wordt ergens anders in het genoom (trans)
aangemaakt. Vormt 3 RNA stam lussen. Functie: interactie met Cas9
4. Cas9: enzyme dat doel DNA knipt
a. Functie: herkennen gRNA + enzym dat ontwindt en knipt.
b. Enzyme heeft 2 nuclease domeinen:
i. RuvC nuclease domein: knipt doel DNA 3bp ‘upstream’ van PAM
ii. HNH nuclease domein : knipt complementair deel van doel DNA streng die
basenpaart met sgRNA
Werkingsmechanisme van CRISPR/Cas9
1) Vorming van sgRNA-Cas9 complex (Cas9 is intrinsiek in auto-
inhibitie)
2) Herkenning van een PAM sequentie
• Herkenning PAM sequentie => DNA streng komt los van
elkaar: gRNA kan interageren met DNA
• Geen herkenning => geen interactie tussen complex en DNA
3) Interactie tussen gRNA en doelDNA
4) Introduceren van een double stranded break (DSB)
• HNH-domein knipt doel DNA streng en RuvC domein knipt “non target” streng
1
, • DSB gebeurt 3 nt stroomopwaarts van de PAM
sequentie bij Cas9 eiwit
Om gewenste sequentie te modificeren wordt DNA hersteld
Voor het uiteindelijk modificeren van de gewenste
sequentie wordt beroep gedaan op de eigen DNA-
herstelcapaciteit van de cel.
- Nonhomologous end joining (NHEJ)
Onnauwkeurig herstelproces (inserties, deleties), als
dit in een coderend gen voorkomt:
leesraamverschuiving, prematuur stopcodon,
verandering EW functie
Herstelt door twee uiteinden chemisch te verbinden.
Toepassing: NHEJ wordt gebruikt voor knock-out van genen
- Homology directed repair (HDR)
Nauwkeurig herstel van DSB door middel van homologe recombinatie met homoloog DNA.
Gebruikt DNA-template voor nauwkeurig herstel. Homologe streng kan dicht gelokaliseerd
zijn zoals zusterchromatide of een extern toegevoegde donorDNA-template.
Toepassing: knock-in van DNA-sequenties, dus voor specifieke gencorrecties
Bespreek de verschillende onderdelen van Crispr-Cas die aanleiding geven tot een DSB en hun
functie tot in detail.
1. Cas9: enzyme dat doel DNA knipt
a. Functie: herkennen gRNA + enzym dat ontwindt en knipt.
b. Enzyme heeft 2 nuclease domeinen:
i. RuvC nuclease domein: knipt doel DNA 3bp ‘upstream’ van PAM
ii. HNH nuclease domein : knipt complementair deel van doel DNA streng die
basenpaart met sgRNA
Je kan de 2 herstelmechanismen van een DSB uitleggen. Hoe kan je een gen toevoegen met
CrisprCas? Hoe kan je frameshift creëren in je ORF met Crispr-Cas opdat je een niet functioneel gen
bekomt? Hoe kan je een puntmutatie introduceren ahv Crispr-Cas (op 2 manieren!)?
NHEJ en HDR: zie erboven
NHEJ kan gebruikt worden voor knock-out. NHEJ voegt uiteinden chemisch aan elkaar waardoor er
fouten voorkomen, deze maken proteïnen inactief door frameshift mutaties
HDR kan gebruikt worden knock-in: door donor template toe te voegen kan een specifiek gen
ingebouwd worden.
Je kent de verschillende strategieën voor het verkrijgen van een functioneel Cas9-sgRNA
ribonucleoproteïne in de celkern met hun voor-of nadeel.
Meerdere beperkingen om complex in specifieke doelcellen te krijgen:
- Positief geladen Cas eiwit en negatief geladen fosfaatruggengraat van gRNA over
celmembraan krijgen.
- Concentratie en aanwezigheidsduur van gRNA en Cas9-eiwit is belangrijk (te veel of te lang
leidt tot off-target genmodificatie)
- Als niet alle lichaamscellen maar bepaalde cellen of weefsels worden getarget
- Rekening houden met cellulaire degradatie door proteasen, RNAs of lysosymen en vermijden
van een eventuele immuunrespons.
3 strategieën voor de cel in te geraken:
2
, 1. DNA-plasmide: Cas9-DNA en sgDNA worden via plasmide in cel gebracht en getransporteerd
naar de nucleus (NLS: AZ geeft tag zodat deze nucleus in komt). Hierna transcriptie naar Cas9
mRNA en sgRNA, naar cytosol voor translatie tot eiwit. Assemblage van het complex volgt,
dan moet het terug de kern is voor modificatie van gDNA. Door eerst transcriptie en
translatie is het effect trager.
Lange expressieduur want DNA-plasmide = stabiel. Groter risico op immuunrespons en off-
target effecten.
Voorbeeld vector:
U6 RNA polymerase promotor: sterke promotor voor hairpin genen
(tracerRNA) = het gele balkje
CMV: cytomegalovirus RNA-polymerase promotor voor heel grote
genen, T7 promotor voor bacterie.
Cas9/GFP fusieproteine verbonden door eiwit 2A (+NLS)
DNA plasmide in prokaryote cel (E. coli) brengen om DNA te
vermenigvuldigen, daarna isoleren en in eukaryote celkern brengen.
2. mRNA en sgRNA cargo
Cas9-mRNA en sgRNA worden in cytoplasma gebracht (apart of samen in 1 plasmide), hierna
volgt onmiddellijke translatie. Assemblage van complex + transport naar kern voor
modificatie van gDNA
snel effect, zonder transcriptie, kortere expressie door celullaire degradatie van RNA-
fragmenten, ook betere controle over concentratie en expressieduur.
Snelle degradatie waardoor geen efficiënte genmodificatie mogelijk is tenzij gewerkt wordt
met chemisch gemodificeerde RNA moleculen die stabiliteit verhogen.
3. Cas9-sgRNA ribonucleoproteïne cargo
Cas9-sgRNA riboproteinecomplex aangeleverd in cytoplasma, enkel transport naar de kern
nodig waar het complex vervolgens genetische modificaties kan aanbrengen
Onmiddellijk therapeutisch effect
Snelle degradatie
Twee grote types van transportvectoren:
1. Virale transportvectoren
2. Niet virale transportvectoren
a. Micro-injectie
Plasmide inbrengen in cel door middel van een naad, celmembraan wordt doorprikt
Goede controle van conc. van de geinjecteerde hoeveelheden
b. Elektroporatie
pulserend hoog voltage elektrisch signaal maakt poriën in celmembraan, deze laten
transport van macromoleculen toe.
Eenvoudige techniek, relatief snel (50 cellen per keer)
Enkel ex vivo toepasbaar
c. Mechanische celdeformatie
Cellen worden geleid door een tunnel met een kleinere diameter dan de
celdiameter. Als reactie op de plotse membraandeformatie ontstaan poriën
waarlangs macromoleculen kunnen passeren.
Gemakkelijke techniek en hogere celviabiliteit
Enkel ex vivo
In vivo transportmechanismen:
• Hydrodynamische injectie: door injectie van grote volumes vloeistof in bloedbaan (8-10% van
lichaamsgewicht). Bloed is niet comprimeerbaar, bolusinjectie leidt tot toegenomen
3
, hydrodynamische druk en vorming van poriën thv celmembraan
Techniek werkt goed bij kleine proefdieren, maar niet voor humaan gebruik (hartstilstand,
leververgroting à lethaal)
• Nanopartikels: cargo’s worden omkapseld met nanopartikels zoals lipiden, polymeren of
goud. Meest succesvol zijn kationische lipiden (vormen complex met negatief geladen
RNA/DNA. Omkapseling biedt protectie tegen degradatie en immuunrespons en kunnen
indien gewenst specifieke oppervlaktereceptoren van de gewenste doelcellen herkennen
Je kan de verschillende onderdelen van een gegeven Crispr/cas vector uitleggen. àzie plasmide
Hoe kan je Crispr/Cas in vivo toedienen?
hydrodynamische injectie: door injectie van grote volumes vloeistof in bloedbaan (8-10% van
lichaamsgewicht). Werking: bloed is niet comprimeerbaar, bolusinjectie leidt tot toegenomen
hydrodynamische druk en vorming van poriën thv celmembraan.
Techniek werkt goed bij kleine proefdieren,bij humaan gebruik lethaal (hartstilstand, leververgroting)
Nanopartikels: cargo’s worden omkapseld met nanopartikels lipiden, polymeren of goud. Meest
succesvol: kationische lipiden (vormen complex met negatief geladen DNA of RNA)
Omkapseling biedt bescherming tegen degradatie en immuunrespons en kunnen indien gewenst
specifieke oppervlakte receptoren van de gewenste doelcellen herkennen (cel-specifieke targets)
Wat is een dCas9 en en beschrijf minimum 1 toepassing.
Katalytisch inactief Cas
Niet enkel gebruik om genen uit te schakelen, maar ook om genexpressie te moduleren via nuclease-
deactivated Cas9 (dCas9)
Bindt aan doelsequentie maar kan geen DSB introduceren (mutatie in RuvC en HNH)
Wel reguleert het regulatie van RNA transcriptie => activatoren of repressoren
- CRISPR interference (CRISPRi): dCas9 en standaard sgRNA dat promotor bindt
=> transcriptionele genrepressie
- CRISPR activation (CRISPRa): dCas9 gekoppeld aan transcriptioneel activatiedomein dat aan
genpromotor bindt. Via activatiedomein worden extra effectoren gerecruiteerd voor
transcriptionele activatie of verhoogde genexpressie van het doelgen.
- Epigenomische veranderingen: dCas9 gekoppeld aan methylcystosine dioxygenase (TET1)
met sgRNA specifiek voor gen geassocieerd met fragile X syndroom, om dit te demethyleren.
- CRISPR base editors: dCas9 gefusioneerd met cytidine deaminase of adenosine deaminase
om 1 specifiek nt te veranderen
- RNA targeting
- Fluorescentie tag op katalytisch inactieve Cas: RNA visualisatie en tracking
Hoe ga je RNA knippen mbv Crispr/Cas?
Niet zeker
RNA targeting door gebruik te maken van speciale Cas eiwitten: Rcas9, Cas13. Kunnen knip maken in
een enkele streng RNA
Bespreek de mogelijke nadelen van het gebruik van Crispr/Cas.
Aanleveren van het ribonucleocomplex aan de cellen: vaak worden virale veectoren gebruikt met
beperkte packaging capaciteit of DNA is te stabiel waardoor te lange sgRNA/Cas9 expressie met risico
op onbedoelde neveneffecten.
Off target effects: selecteer en optimaliseer sgRNA voor het experiment
Immunogeniciteit van Cas eiwitten is problematisch voor klinische toepassingen.
4
Hoofdstuk 1: Crispr/Cas
Leg uit hoe je een gen kan editen met Crispr-Cas ahv 2 grote stappen. Je kan het mechanisme van
iedere stap volledig beschrijven.
dsDNA knippen op sequentie-specifieke wijze
1. Eerste onderdeel in CRISPR-Cas systeem: verantwoordelijk voor herkenning van gewenste
DNA-sequentie:
a. sgRNA: een kort RNA fragment bestaande uit 2 onderdelen:
i. Herkenningssequentie aan het te modifiëren gDNA (= CrRNA)
ii. Herkenningssequentie om Cas9 te binden (= tracerRNA)
b. PAM sequentie: Protospacer Adjacent Motif
Sequentie die onmiddelijk stroomafwaarts van de doelsequentie ligt en zodoende
bepaalt waar het DNA gekliefd zal worden.
PAM bepaalt op die manier doelsequentie van gRNA
2. Tweede onderdeel is verantwoordelijk voor sgRNA binding, helicase en nuclease activiteit
a. Cas eiwit: enzyme dat het doelDNA “denatureert” en knipt
Meest populaire Cas enzyme is Cas9 protein
Geeef sleutecomponenten (examenvraag december ’22):
1. Doel of Target DNA: genomische regio die gemodifieerd wordt
2. PAM sequentie: maakt deel uit van doelsequentie en bindt Cas9: kiest waar de knip is
3. gRNA: kort RNA fragment, bindt Cas9 + herkenningssequentie
a. CrRNA: 20nt aan het 5’ uiteinde van gRNA, complementair aan doel DNA: functie:
herkent het doel DNA
b. Transactiverend CRISPR RNA (tracrRNA): wordt ergens anders in het genoom (trans)
aangemaakt. Vormt 3 RNA stam lussen. Functie: interactie met Cas9
4. Cas9: enzyme dat doel DNA knipt
a. Functie: herkennen gRNA + enzym dat ontwindt en knipt.
b. Enzyme heeft 2 nuclease domeinen:
i. RuvC nuclease domein: knipt doel DNA 3bp ‘upstream’ van PAM
ii. HNH nuclease domein : knipt complementair deel van doel DNA streng die
basenpaart met sgRNA
Werkingsmechanisme van CRISPR/Cas9
1) Vorming van sgRNA-Cas9 complex (Cas9 is intrinsiek in auto-
inhibitie)
2) Herkenning van een PAM sequentie
• Herkenning PAM sequentie => DNA streng komt los van
elkaar: gRNA kan interageren met DNA
• Geen herkenning => geen interactie tussen complex en DNA
3) Interactie tussen gRNA en doelDNA
4) Introduceren van een double stranded break (DSB)
• HNH-domein knipt doel DNA streng en RuvC domein knipt “non target” streng
1
, • DSB gebeurt 3 nt stroomopwaarts van de PAM
sequentie bij Cas9 eiwit
Om gewenste sequentie te modificeren wordt DNA hersteld
Voor het uiteindelijk modificeren van de gewenste
sequentie wordt beroep gedaan op de eigen DNA-
herstelcapaciteit van de cel.
- Nonhomologous end joining (NHEJ)
Onnauwkeurig herstelproces (inserties, deleties), als
dit in een coderend gen voorkomt:
leesraamverschuiving, prematuur stopcodon,
verandering EW functie
Herstelt door twee uiteinden chemisch te verbinden.
Toepassing: NHEJ wordt gebruikt voor knock-out van genen
- Homology directed repair (HDR)
Nauwkeurig herstel van DSB door middel van homologe recombinatie met homoloog DNA.
Gebruikt DNA-template voor nauwkeurig herstel. Homologe streng kan dicht gelokaliseerd
zijn zoals zusterchromatide of een extern toegevoegde donorDNA-template.
Toepassing: knock-in van DNA-sequenties, dus voor specifieke gencorrecties
Bespreek de verschillende onderdelen van Crispr-Cas die aanleiding geven tot een DSB en hun
functie tot in detail.
1. Cas9: enzyme dat doel DNA knipt
a. Functie: herkennen gRNA + enzym dat ontwindt en knipt.
b. Enzyme heeft 2 nuclease domeinen:
i. RuvC nuclease domein: knipt doel DNA 3bp ‘upstream’ van PAM
ii. HNH nuclease domein : knipt complementair deel van doel DNA streng die
basenpaart met sgRNA
Je kan de 2 herstelmechanismen van een DSB uitleggen. Hoe kan je een gen toevoegen met
CrisprCas? Hoe kan je frameshift creëren in je ORF met Crispr-Cas opdat je een niet functioneel gen
bekomt? Hoe kan je een puntmutatie introduceren ahv Crispr-Cas (op 2 manieren!)?
NHEJ en HDR: zie erboven
NHEJ kan gebruikt worden voor knock-out. NHEJ voegt uiteinden chemisch aan elkaar waardoor er
fouten voorkomen, deze maken proteïnen inactief door frameshift mutaties
HDR kan gebruikt worden knock-in: door donor template toe te voegen kan een specifiek gen
ingebouwd worden.
Je kent de verschillende strategieën voor het verkrijgen van een functioneel Cas9-sgRNA
ribonucleoproteïne in de celkern met hun voor-of nadeel.
Meerdere beperkingen om complex in specifieke doelcellen te krijgen:
- Positief geladen Cas eiwit en negatief geladen fosfaatruggengraat van gRNA over
celmembraan krijgen.
- Concentratie en aanwezigheidsduur van gRNA en Cas9-eiwit is belangrijk (te veel of te lang
leidt tot off-target genmodificatie)
- Als niet alle lichaamscellen maar bepaalde cellen of weefsels worden getarget
- Rekening houden met cellulaire degradatie door proteasen, RNAs of lysosymen en vermijden
van een eventuele immuunrespons.
3 strategieën voor de cel in te geraken:
2
, 1. DNA-plasmide: Cas9-DNA en sgDNA worden via plasmide in cel gebracht en getransporteerd
naar de nucleus (NLS: AZ geeft tag zodat deze nucleus in komt). Hierna transcriptie naar Cas9
mRNA en sgRNA, naar cytosol voor translatie tot eiwit. Assemblage van het complex volgt,
dan moet het terug de kern is voor modificatie van gDNA. Door eerst transcriptie en
translatie is het effect trager.
Lange expressieduur want DNA-plasmide = stabiel. Groter risico op immuunrespons en off-
target effecten.
Voorbeeld vector:
U6 RNA polymerase promotor: sterke promotor voor hairpin genen
(tracerRNA) = het gele balkje
CMV: cytomegalovirus RNA-polymerase promotor voor heel grote
genen, T7 promotor voor bacterie.
Cas9/GFP fusieproteine verbonden door eiwit 2A (+NLS)
DNA plasmide in prokaryote cel (E. coli) brengen om DNA te
vermenigvuldigen, daarna isoleren en in eukaryote celkern brengen.
2. mRNA en sgRNA cargo
Cas9-mRNA en sgRNA worden in cytoplasma gebracht (apart of samen in 1 plasmide), hierna
volgt onmiddellijke translatie. Assemblage van complex + transport naar kern voor
modificatie van gDNA
snel effect, zonder transcriptie, kortere expressie door celullaire degradatie van RNA-
fragmenten, ook betere controle over concentratie en expressieduur.
Snelle degradatie waardoor geen efficiënte genmodificatie mogelijk is tenzij gewerkt wordt
met chemisch gemodificeerde RNA moleculen die stabiliteit verhogen.
3. Cas9-sgRNA ribonucleoproteïne cargo
Cas9-sgRNA riboproteinecomplex aangeleverd in cytoplasma, enkel transport naar de kern
nodig waar het complex vervolgens genetische modificaties kan aanbrengen
Onmiddellijk therapeutisch effect
Snelle degradatie
Twee grote types van transportvectoren:
1. Virale transportvectoren
2. Niet virale transportvectoren
a. Micro-injectie
Plasmide inbrengen in cel door middel van een naad, celmembraan wordt doorprikt
Goede controle van conc. van de geinjecteerde hoeveelheden
b. Elektroporatie
pulserend hoog voltage elektrisch signaal maakt poriën in celmembraan, deze laten
transport van macromoleculen toe.
Eenvoudige techniek, relatief snel (50 cellen per keer)
Enkel ex vivo toepasbaar
c. Mechanische celdeformatie
Cellen worden geleid door een tunnel met een kleinere diameter dan de
celdiameter. Als reactie op de plotse membraandeformatie ontstaan poriën
waarlangs macromoleculen kunnen passeren.
Gemakkelijke techniek en hogere celviabiliteit
Enkel ex vivo
In vivo transportmechanismen:
• Hydrodynamische injectie: door injectie van grote volumes vloeistof in bloedbaan (8-10% van
lichaamsgewicht). Bloed is niet comprimeerbaar, bolusinjectie leidt tot toegenomen
3
, hydrodynamische druk en vorming van poriën thv celmembraan
Techniek werkt goed bij kleine proefdieren, maar niet voor humaan gebruik (hartstilstand,
leververgroting à lethaal)
• Nanopartikels: cargo’s worden omkapseld met nanopartikels zoals lipiden, polymeren of
goud. Meest succesvol zijn kationische lipiden (vormen complex met negatief geladen
RNA/DNA. Omkapseling biedt protectie tegen degradatie en immuunrespons en kunnen
indien gewenst specifieke oppervlaktereceptoren van de gewenste doelcellen herkennen
Je kan de verschillende onderdelen van een gegeven Crispr/cas vector uitleggen. àzie plasmide
Hoe kan je Crispr/Cas in vivo toedienen?
hydrodynamische injectie: door injectie van grote volumes vloeistof in bloedbaan (8-10% van
lichaamsgewicht). Werking: bloed is niet comprimeerbaar, bolusinjectie leidt tot toegenomen
hydrodynamische druk en vorming van poriën thv celmembraan.
Techniek werkt goed bij kleine proefdieren,bij humaan gebruik lethaal (hartstilstand, leververgroting)
Nanopartikels: cargo’s worden omkapseld met nanopartikels lipiden, polymeren of goud. Meest
succesvol: kationische lipiden (vormen complex met negatief geladen DNA of RNA)
Omkapseling biedt bescherming tegen degradatie en immuunrespons en kunnen indien gewenst
specifieke oppervlakte receptoren van de gewenste doelcellen herkennen (cel-specifieke targets)
Wat is een dCas9 en en beschrijf minimum 1 toepassing.
Katalytisch inactief Cas
Niet enkel gebruik om genen uit te schakelen, maar ook om genexpressie te moduleren via nuclease-
deactivated Cas9 (dCas9)
Bindt aan doelsequentie maar kan geen DSB introduceren (mutatie in RuvC en HNH)
Wel reguleert het regulatie van RNA transcriptie => activatoren of repressoren
- CRISPR interference (CRISPRi): dCas9 en standaard sgRNA dat promotor bindt
=> transcriptionele genrepressie
- CRISPR activation (CRISPRa): dCas9 gekoppeld aan transcriptioneel activatiedomein dat aan
genpromotor bindt. Via activatiedomein worden extra effectoren gerecruiteerd voor
transcriptionele activatie of verhoogde genexpressie van het doelgen.
- Epigenomische veranderingen: dCas9 gekoppeld aan methylcystosine dioxygenase (TET1)
met sgRNA specifiek voor gen geassocieerd met fragile X syndroom, om dit te demethyleren.
- CRISPR base editors: dCas9 gefusioneerd met cytidine deaminase of adenosine deaminase
om 1 specifiek nt te veranderen
- RNA targeting
- Fluorescentie tag op katalytisch inactieve Cas: RNA visualisatie en tracking
Hoe ga je RNA knippen mbv Crispr/Cas?
Niet zeker
RNA targeting door gebruik te maken van speciale Cas eiwitten: Rcas9, Cas13. Kunnen knip maken in
een enkele streng RNA
Bespreek de mogelijke nadelen van het gebruik van Crispr/Cas.
Aanleveren van het ribonucleocomplex aan de cellen: vaak worden virale veectoren gebruikt met
beperkte packaging capaciteit of DNA is te stabiel waardoor te lange sgRNA/Cas9 expressie met risico
op onbedoelde neveneffecten.
Off target effects: selecteer en optimaliseer sgRNA voor het experiment
Immunogeniciteit van Cas eiwitten is problematisch voor klinische toepassingen.
4
