MOLECULAIRE BIOLOGIE
1. Eiwit-DNA interactie betrokken bij genregulatie
Transcriptie wordt gecontroleerd door regulerend gebied:
Kleine DNA-elementen met een bepaalde sequentie en sets van gen-regulerende eiwitten
die de sequenties herkennen en binden.
§ ACTIVATOR (eiwit) bindt een ENHANCER (DNA-sequentie) à UP-regulatie
§ REPRESSOR (eiwit) bindt een SILENCER (DNA-sequentie) à DOWN-regulatie
Co-activatoren/co-repressoren binden DNA niet rechtstreeks maar door eiwit-eiwit
interacties.
DBD = DNA-bindingsdomein. a-helix of b-sheet van EW dat bindt in major groeve DNA via
niet-covalente interacties. Eiwit bindt DNA, zorgt voor conformationele verandering, buiging
van het DNA.
Een domein is een goed gedefinieerd gebied van een eiwit dat ofwel een specifieke functie
uitvoert ofwel een stabiele compacte structurele eenheid binnen het eiwit vormt. Elke
verschillende functie van een eiwit kan geassocieerd worden aan een bepaald domein. Deze
domeinen kunnen van elkaar onderscheiden worden en zijn verbonden via flexibele
linkerdelen. Domeinen bestaan uit meerdere motieven, dit is een combinatie van secundaire
structuurelementen.
§ DBD
§ Transcriptie regulatiedomein: activatiedomein/repressiedomein
§ Dimerisatie domein: veel EW binden DNA als een dimeer
§ Ligand bindingsdomein
§ Nucleair lokaliserend signaal: om eiwitten naar de kern af te voeren.
§ Nucleair export signaal: eiwitten uit kern verwijderen.
Helix-turn-helix motief
Twee korte a-helices verbonden door 4tal AZ, genaamd b-turn.
De twee helices staan in interactie met elkaar in een vaste hoek.
Herkenningshelix + stabilisatie helix.
Zink vinger motief
Cysteïne en histidine residu’s cheleren een of meerdere Zn
atomen. a-herkenningshelix bindt major groeve van DNA, b-
vouwblad staat in interactie met suiker-fosfaat ruggengraat.
Basisch leucine zipper motief
Vervlechting van twee monomeren, dimeervorming. Kleine a-
helix met om de 7 AZ een leucine residu.
Basisch helix loop helix motief
Twee a-helices verbonden met een variabele lus. Door flexibiliteit van de loop en hydrofobe
interacties tussen de helices bekom je de parallelle configuratie.
1
, 2. Genexpressie in eukaryoten
Verschillende RNA-polymerases:
Soort Locatie Aanmaak a-amanitine (paddenstoel)
RNA-polymerase I Nucleolus Pre-rRNA Ongevoelig voor a-amanitine
RNA-polymerase II Nucleoplasma Pre-mRNA Gevoelig voor a-amanitine in
lage concentratie
RNA-polymerase Nucleoplasma tRNA, rRNA, scRNA Gevoelig voor a-amanitine in
III hoge concentratie
Elk RNA polymerase vereist algemene transcriptie factoren (GTF).
RNA-polymerase vereist transcriptiefactoren TFII gevolgd door een letter.
Activatoren/repressoren die andere regulerende sequenties gaan binden specifiek voor elk
type gen.
De basale core promotor vertoont tot 5 elementen:
1. Inr: initiator. Transcriptie start op +1
2. MTE: motif ten element. Ondersteunt transcriptie en helpt TFIID binden.
3. DPE: downstream promotor element, stroomafwaarts van +1
4. TATA-box: stroomopwaarts van +1
5. BREU: TFIIB recognition element (upstream), vlak voor TATA-box
6. BRED: TFIIB recognition element (downstream), vlak na TATA-box
Transcriptie initiatie door binding van RNA-polymerase II aan de core promotor. Dit vereist 6
GTF’s: TFIIA,B,C,D,E,F,H => vormt samen Pre-Initiatie-Complex (PIC).
1) TFIID bestaat uit:
§ TATA-box bindingsproteïne (TBP), bindt TATA in de minor groeve
§ 14 kleinere TBP-geassocieerde factoren (TAF’s). Worden aangeduid
met hun moleculaire massa of een nummer. Dienen als geraamte
waaraan andere GTF’s en co-activators aan binden.
TBP bindt met concave zijde TATA waardoor DNA 80° buigt.
De concave zijde interageert met de andere GTF’s.
TAF1 en TAF2 binden Inr
TAF6 en TAF9 binden DPE
2) TFIIA en TFIIB binden door DNA buiging.
TFIIA stabiliseert de TBP binding aan TATA
TFIIB BREU en BRED
3) RNA-polymerase II bindt samen met TFIIF aan Inr
TFIIF brengt matrijs streng in actieve plaats van RNA-polymerase II.
2
, 4) TFIIE en TFIIH binden het complex è PIC
TFIIH is een ATPase en helicase, ontwindt DNA ter vorming van een open promotor
complex. Ook kinase activiteit door RNA-polymerase II te fosforyleren = activeren.
5) RNA-polymerase in complex met TFIIF komt los van promotor en RNA synthese start
op +1.
De andere TF komen los van geheel.
Stroomopwaarts (-50 tot -200) van de core promotor bevinden zich
regulatorische elementen:
§ GC box: bindt met SP1 factor, dit interageert met TAFII130 van TFIID
à verhoogt de efficiëntie van de initiatie
§ CAAT box: bindt met CBF factor
à verandert chromatine structuur
§ OCT box: bindt met OTF-1
Prokaryote genen zijn geclusterd en wordt samen door een operon gereguleerd.
Eukaryote genen komen fysisch verspreid voor over meerdere chromosomen.
Responsieve elementen zorgen voor gecoördineerde expressie. Externe signalen zorgen
voor aan- en uitschakeling van transcriptie.
Gelegen stroomopwaarts dichtbij TATA (max op -1000).
Enhancers en silencers komen stroomopwaarts, stroomafwaarts of in intron gebieden voor.
Ze zorgen voor up- en down-regulatie van de transcriptie. Een activator (eiwit) bindt een
enhancer, een repressor bindt een silencer.
Activators/repressors gebonden aan enhancers/silencers vergelegen van de promotor
worden dichter gebracht door DNA-looping, dit vereist:
o Architecturale DNA buigingseiwitten: CTCF-cohesine complex:
CTCF factoren (11 Zink vinger motieven) worden opgehangen aan insulators,
hierdoor kan ringvormig cohesine eiwit complex rond de looping gaan en stabiliseren
Chromatine structuur krijgt rozette structuur, verankering met nuclaire EW
Insulator = barrière waardoor enhancers/silencers de promotor van een ander gen
niet kan beïnvloeden.
o Stabiliserende enhancer RNA’s
o Mediator: batterij van co-activatoren/co-repressors à eiwit-eiwit interactie
Groot eiwitcomplex als moleculaire brug tussen de activatie/repressie domeinen van
de gebonden (co-)activator/(co-)repressor eiwitten en de andere TF. Brengt signalen
van TF over naar RNA polymerase 2. Brug tussen AD en
transcriptie machinerie.
3
1. Eiwit-DNA interactie betrokken bij genregulatie
Transcriptie wordt gecontroleerd door regulerend gebied:
Kleine DNA-elementen met een bepaalde sequentie en sets van gen-regulerende eiwitten
die de sequenties herkennen en binden.
§ ACTIVATOR (eiwit) bindt een ENHANCER (DNA-sequentie) à UP-regulatie
§ REPRESSOR (eiwit) bindt een SILENCER (DNA-sequentie) à DOWN-regulatie
Co-activatoren/co-repressoren binden DNA niet rechtstreeks maar door eiwit-eiwit
interacties.
DBD = DNA-bindingsdomein. a-helix of b-sheet van EW dat bindt in major groeve DNA via
niet-covalente interacties. Eiwit bindt DNA, zorgt voor conformationele verandering, buiging
van het DNA.
Een domein is een goed gedefinieerd gebied van een eiwit dat ofwel een specifieke functie
uitvoert ofwel een stabiele compacte structurele eenheid binnen het eiwit vormt. Elke
verschillende functie van een eiwit kan geassocieerd worden aan een bepaald domein. Deze
domeinen kunnen van elkaar onderscheiden worden en zijn verbonden via flexibele
linkerdelen. Domeinen bestaan uit meerdere motieven, dit is een combinatie van secundaire
structuurelementen.
§ DBD
§ Transcriptie regulatiedomein: activatiedomein/repressiedomein
§ Dimerisatie domein: veel EW binden DNA als een dimeer
§ Ligand bindingsdomein
§ Nucleair lokaliserend signaal: om eiwitten naar de kern af te voeren.
§ Nucleair export signaal: eiwitten uit kern verwijderen.
Helix-turn-helix motief
Twee korte a-helices verbonden door 4tal AZ, genaamd b-turn.
De twee helices staan in interactie met elkaar in een vaste hoek.
Herkenningshelix + stabilisatie helix.
Zink vinger motief
Cysteïne en histidine residu’s cheleren een of meerdere Zn
atomen. a-herkenningshelix bindt major groeve van DNA, b-
vouwblad staat in interactie met suiker-fosfaat ruggengraat.
Basisch leucine zipper motief
Vervlechting van twee monomeren, dimeervorming. Kleine a-
helix met om de 7 AZ een leucine residu.
Basisch helix loop helix motief
Twee a-helices verbonden met een variabele lus. Door flexibiliteit van de loop en hydrofobe
interacties tussen de helices bekom je de parallelle configuratie.
1
, 2. Genexpressie in eukaryoten
Verschillende RNA-polymerases:
Soort Locatie Aanmaak a-amanitine (paddenstoel)
RNA-polymerase I Nucleolus Pre-rRNA Ongevoelig voor a-amanitine
RNA-polymerase II Nucleoplasma Pre-mRNA Gevoelig voor a-amanitine in
lage concentratie
RNA-polymerase Nucleoplasma tRNA, rRNA, scRNA Gevoelig voor a-amanitine in
III hoge concentratie
Elk RNA polymerase vereist algemene transcriptie factoren (GTF).
RNA-polymerase vereist transcriptiefactoren TFII gevolgd door een letter.
Activatoren/repressoren die andere regulerende sequenties gaan binden specifiek voor elk
type gen.
De basale core promotor vertoont tot 5 elementen:
1. Inr: initiator. Transcriptie start op +1
2. MTE: motif ten element. Ondersteunt transcriptie en helpt TFIID binden.
3. DPE: downstream promotor element, stroomafwaarts van +1
4. TATA-box: stroomopwaarts van +1
5. BREU: TFIIB recognition element (upstream), vlak voor TATA-box
6. BRED: TFIIB recognition element (downstream), vlak na TATA-box
Transcriptie initiatie door binding van RNA-polymerase II aan de core promotor. Dit vereist 6
GTF’s: TFIIA,B,C,D,E,F,H => vormt samen Pre-Initiatie-Complex (PIC).
1) TFIID bestaat uit:
§ TATA-box bindingsproteïne (TBP), bindt TATA in de minor groeve
§ 14 kleinere TBP-geassocieerde factoren (TAF’s). Worden aangeduid
met hun moleculaire massa of een nummer. Dienen als geraamte
waaraan andere GTF’s en co-activators aan binden.
TBP bindt met concave zijde TATA waardoor DNA 80° buigt.
De concave zijde interageert met de andere GTF’s.
TAF1 en TAF2 binden Inr
TAF6 en TAF9 binden DPE
2) TFIIA en TFIIB binden door DNA buiging.
TFIIA stabiliseert de TBP binding aan TATA
TFIIB BREU en BRED
3) RNA-polymerase II bindt samen met TFIIF aan Inr
TFIIF brengt matrijs streng in actieve plaats van RNA-polymerase II.
2
, 4) TFIIE en TFIIH binden het complex è PIC
TFIIH is een ATPase en helicase, ontwindt DNA ter vorming van een open promotor
complex. Ook kinase activiteit door RNA-polymerase II te fosforyleren = activeren.
5) RNA-polymerase in complex met TFIIF komt los van promotor en RNA synthese start
op +1.
De andere TF komen los van geheel.
Stroomopwaarts (-50 tot -200) van de core promotor bevinden zich
regulatorische elementen:
§ GC box: bindt met SP1 factor, dit interageert met TAFII130 van TFIID
à verhoogt de efficiëntie van de initiatie
§ CAAT box: bindt met CBF factor
à verandert chromatine structuur
§ OCT box: bindt met OTF-1
Prokaryote genen zijn geclusterd en wordt samen door een operon gereguleerd.
Eukaryote genen komen fysisch verspreid voor over meerdere chromosomen.
Responsieve elementen zorgen voor gecoördineerde expressie. Externe signalen zorgen
voor aan- en uitschakeling van transcriptie.
Gelegen stroomopwaarts dichtbij TATA (max op -1000).
Enhancers en silencers komen stroomopwaarts, stroomafwaarts of in intron gebieden voor.
Ze zorgen voor up- en down-regulatie van de transcriptie. Een activator (eiwit) bindt een
enhancer, een repressor bindt een silencer.
Activators/repressors gebonden aan enhancers/silencers vergelegen van de promotor
worden dichter gebracht door DNA-looping, dit vereist:
o Architecturale DNA buigingseiwitten: CTCF-cohesine complex:
CTCF factoren (11 Zink vinger motieven) worden opgehangen aan insulators,
hierdoor kan ringvormig cohesine eiwit complex rond de looping gaan en stabiliseren
Chromatine structuur krijgt rozette structuur, verankering met nuclaire EW
Insulator = barrière waardoor enhancers/silencers de promotor van een ander gen
niet kan beïnvloeden.
o Stabiliserende enhancer RNA’s
o Mediator: batterij van co-activatoren/co-repressors à eiwit-eiwit interactie
Groot eiwitcomplex als moleculaire brug tussen de activatie/repressie domeinen van
de gebonden (co-)activator/(co-)repressor eiwitten en de andere TF. Brengt signalen
van TF over naar RNA polymerase 2. Brug tussen AD en
transcriptie machinerie.
3
