Samenvatting Chromatografie - Analytische Biochemie 1

H5: Chromatografische scheiding
THEORETISCHE BESCHRIJVING VAN CHROMATOGRAFIE

Defini&e: scheiden van opgeloste stoffen met een chromatografisch medium (verdelende deeltjes ve kolom, dunlaagplaat…)

• Chromatografisch medium: zorgt voor selec@eve vertraging van bepaalde opgeloste stoffen
• Scheiding: gevolg vd differen@ële migra@e vd opgeloste stoffen door een versch. verdeling over de mobiele en
sta@onaire fase van het systeem: A mobiel ↔ A sta+onair


DISTRIBUTIECOËFFICIËNT EN VERDELINGSISOTHERMEN


VERDELINGSFACTOR k & VERDELINGSCONSTANTE K

Verdeling ve opgeloste stof over sta@onaire- en mobiele fase bepaald door de verdelingsfactor k (ook wel capaciteitsfactor of
reten@efactor genoemd) en de verdelingsconstante K

m!"#"$%&#$'
k= (1)
m(%)$*+

𝐶,-.-/01./2 𝑚,-.-/01./2 𝑉304/56
𝐾= = . (2)
𝐶304/56 𝑉,-.-/01./2 𝑚304/56

𝑉304/56 𝑉,-.-/01./2
𝐾 = 𝑘. 𝑒𝑛 𝑘 = 𝐾. (3)
𝑉,-.-/01./2 𝑉304/56




VERDELINGISOTHERMEN

Verdelingsisoterm: gee] rela@e tussen hoeveelheid opgeloste stof in de sta@onaire fase en de concentra@e opgeloste stof in de
mobiele fase.

3 types verdelingsisothermen:

- Lineaire isotherm: verdelingsfactor is onafhankelijk van de concentratie aan opgeloste stof
- Isotherm waarbij de verdelingsfactor daalt bij oplopende concentratie in de mobiel fase
→ minder binding aan stationaire fase bij hoge concentraties in de mobiele fase
- isotherm waarbij de verdelingsfactor stijgt met de concentratie




34

,LINEAIRE SNELHEID EN RETENTIETIJD


Kolomchromatografie: scheiden ve mengsel van opgeloste stoffen door een klein volume op een kolom te laden waardoor het
mengsel in zone’s verdeeld wordt door een verschil in affiniteit voor de sta@onaire fase

Als opgeloste stof op kolom gebracht wordt, zal verdeling vd stof plaatsgrijpen over sta@onaire- & mobiele fase

- Debiet: in de mobiele fase is er een debiet F (ml/min), in de sta@onaire fase is het debiet 0
- Lineaire snelheid u (cm/sec) (van de mobiele fase/eluens): gecorreleerd met debiet F

𝐿 𝑉3 𝐹
𝑢= = = (4)
𝑡3 t( 𝐴 𝐴

Met L = de lengte van de kolom; tm = @jd in de mobiele fase; A = opp. vh grondvlak vd kolom (𝜋. 𝑟 8 )
Bij constante snelheid correleren tm en 𝑉3 .

Deze formule geld enkel voor een stof die niet vertraagd wordt door de sta@onaire fase
Indien de stof wel vertraagd wordt, kan de schijnbaar gemiddelde lineaire snelheid (ux) vd eluerende stof gebruikt worden:




Met tR de reten@e@jd en tS de @jd van verblijf in de sta@onaire fase. De reten@e@jd zal al@jd groter zijn dan de @jd van de mobiele
fase!

Er is een bepaald volume (Ve) nodig om alle massa die werd gebonden aan de sta@onaire fase, in de mobiele fase (met
concentra@e Cm) te krijgen. M.a.w. mS /Ve = Cm

Het staal wordt opgevangen zo gauw tm gepasseerd is.




Nu is VR = Vm + Ve (figuur 0-4) en aangezien Ve = k . Vm (zie (6)) kan men stellen dat:




Dus uit VR en Vm kan men k berekenen.
Zo kan men berekenen in welk volume Ve een bepaalde stof zal elueren van de kolom wanneer de k waarde van deze stof en de
Vm waarde van de kolom gekend zijn.

VR noemt men reten@e- of vertragingsvolume, Vm het volume vd mobiele liquide fase en Ve het elu@evolume.

Vm wordt gemeten door chromatografie van een stof waarvoor k=0 à een stof die geen affiniteit hee] voor de kolommatrix. Om
te voorspellen wanneer een bepaalde stof zal elueren van de kolom dient de reten@e@jd tR berekend te worden. Uit (7)
concluderen we:




35

, Deze formule vertoont analogie met (7). Aldus kan de reten@e@jd tR berekend worden adhv. de k waarde en de tm.
Of omgekeerd: de k waarde berekenen adhv. tR en tm :




Veelal gebruikt men de vertragingscoëfficiënt of rela@eve snelheid R:




Aangezien tR = te + tm en VR = Ve + Vm (figuur 0-4) is de verhouding:




En aangezien VR = Vm (1+k) (zie 9) geldt ook:




k variëert van 0 tot ∞. Voor k = 0 is R = 1 of u = ux en loopt de opgeloste stof zonder vertraging door de kolom. Als k = ∞ dan is R
= 0 of ux = 0 en wordt de stof irreversibel gebonden op de kolom.




36