Les 6 – 3D in vitro kankermodellen
• Oncologisch onderzoek op cellen, 2D culturen à muizen à kliniek
• Toenemende druk om in vivo onderzoek te limiteren (ethisch)
- FDA bepaalt of een bepaalde drug in de kliniek mag gebruikt worden of een bepaalde
drug verkocht mag worden à vroegen data van muizen à nu is er een act opgesteld
dat toelaat dat er meer geavanceerde modellen ook gebruikt mogen worden
- Slide 2: Sinds deze maand 3.0 à flexibeler om voor bepaalde behandelingsgroepen
muizen volledig te excluderen en te vervangen door bepaalde een aantal pijlers
Tumor micro-omgeving (TME)
• Focus op in vitro modellen, 2D culturen
• Maar kanker is niet alleen à TME: fibroblasten, immuuncellen, epitheelcellen à voeden mee
de kankercellen
- Kunnen ervoor zorgen dat bepaalde therapieën niet gaan werken
- Hoe representaOef is het om te werken met organoïden?
• Pancreascellen zijn omringd door de micro-omgeving: macrofagen, immuuncellen,
lymfocyten, bindweefselcellen (à gaan ECM uitscheiden), endotheelcellen
• Heel lang gebeurt er onderzoek met 2D modellen à niet representaOef voor paOënt
• Cellen communiceren met elkaar
- Paracriene interacOe: uitscheiden van factoren om cellen te acOveren
o Bv. uitscheiden van groeifactoren door fibroblasten die kankergroei promoten.
o paracrien: bepaalde groeifactoren worden uitgescheiden à binden op
receptoren à acOveren van pathways: ongecontroleerde groei, of resistenOe
tegen therapieën
- Direct celcontact: directe communicaOe tussen cellen
o Bv. fibroblasten die een stromaal schild vormen rond pancreas kankercellen en
deze afschermen van therapieën
• Voedingsstof gradiënt
- Tumorcellen groeien zo snel à bloedvaten kunnen niet volgen à hypoxische
omgeving à kankercellen kunnen zich aanpassen à hierdoor minder gevoelig aan
bepaalde therapieën
- Hypoxie
o AcOvaOe van bv. HIF1alpha
o Invloed op groei, metabolisme, therapierespons
In vitro kankermodellen
Tradi&onele modellen
• Kankercellijnen
- Commercieel beschikbaar
- Nadelen: homogene populaOe (tumor = heterogeen), geneOcdri\ (accumulaOe van
nieuwe mutaOes), beperkte correlaOe met tumor in paOënt
o Van paOënten afgeleid, al heel lang à hoe representaOef voor de kanker die
in de paOënt is gevonden
- Voordelen: meerdere kankercellijnen per tumortype beschikbaar (± 20), zeer goed
gekarakteriseerd (genoom, transcriptome, gevoeligheid voor hele reeks therapieën
reeds bepaald), geïmortaliseerd
, • 2D culturen
- Nadeel: gemiste contact met ECM en cel-cel interacOes, veranderingen van morfologie
en transcriptoom, acOvaOe of inacOvaOe van pathways, geen zuurstof en
voedingsstoffen gradiënt, weinig representaOef voor in vivo TME (hierdoor falen veel
van deze drugs in de kliniek)
- Voordeel: eenvoudig/gestandaardiseerd,reproduceerbaar,goedkoop
3D modellen
• Voordelen: rechtstreeks cel contact wordt behouden + cel-matrix contact, zuurstof en
voedingsstoffen gradiënt, interacOe tussen cellen, co-culturen, recreëren van TME,
mogelijkheid om vascularisaOe en bloedtoevoer na te bootsen
- Platen behandelen met coaOng waardoor cellen niet kunnen binden aan het
oppervlak, maar wel aan elkaar à cel-cel interacOes
• Nadeel: nieuwe protcols implementeren, specifieke know-how vereist, moeilijker om te
analyseren, duurder, reproduceerbaarheid, low throughput
• Scaffold/matrix based
- Extracellulaire matrix (ECM)
- Ontwikkeling van scaffold/hydrogels die ECM nabootsen
- Animal-based: afgeleid, matrigel (> 30 jaar) van muis sarcomacellen
o Bevat collageen, laminine, groeifactoren… (groeifactoren = niet alOjd een
voordeel)
o Nadeel: ethisch (animal-derived), batch-to-batch variability (groeifactoren die
erin zicen zijn niet alOjd goed gekarakteriseerd = variabiliteit), acOvaOe van
immuuncellen (adomsOg van muis immers), verhard bij kamertemperatuur
à koeling nodig,
- Plant-based
o Van cellulose bijvoorbeeld
o Voordeel: gemakkelijker om te gebruiken in het lab, want het is verhard bij
37°C, consistente batches, beter gedefinieerd
- Voorbeelden mulO-spheroid applicaOes
o Ingebedde mulO-spheroiden in 96-well voor drug screening
o Soms migreren de cellen uit de druppel à 2D ook te zien
o AlOjd startende van de matrix waarin je de cellen laat groeien
o Hoe ‘zij’ het meestal doen à in druppeltjes
§ Zie rechts slide 10: verschillende organoïden
à Hier ook 2D: kanker is heel aggressief en gaat binden op het
oppervlak
• Scaffold free
- Meer mechanische methoden om de cellen te sOmuleren om samen te komen
- Single spheroid
- Ultra-low acachment coaOng (ULA)
- Round-bocom microplates
- Hanging-dropmethod
• Tumor-on-a-chip
- Geavanceerder à tumor-on-a-chip is de meest complexe methode
- Kleine chips waar dat je in verschillende zones verschillende soorten cellen kan laten
groeien = microfluids
- InteracOe tussen bloedcellen en kankercellen laten nabootsen
- ComparOmenten met verschillende fysiologische condiOes of cellen
- Complexe analyse en low-throughput
, - Voordeel: relevanter, verschillende organen combineren
- Nadeel: technologische experOse, en analyse daarvan is vaak moeilijk en Ojdrovend
• 3D bioprinten
- Scaffold/hydrogel al dan niet met cellen
- Printen van complexe restructuren
- In combinaOe met chip technologie
Pa&ent afgeleide organoiden
• Organoïden zijn inniOeel ontstaan om organen te kweken in het lab om te zien uit welke
weefsels een orgaan ontstaat
• Kweken van ex vivo paOënt afgeleide tumoren of gezonde organen in 3D
- Celijn is afgeleid van een paOënt à zolang gegroei dat die geïmmortaliseerd is
• MulOcellulaire structuren afgeleid van (kanker)stamcellen
• Behoud genomische, transcriptomische,… karakterisOeken
• DifferenOaOe cellen à heterogene, funcOonele celpopulaOe (bij organoïden afgeleid van
gezond weefsel)
• Self-organising à behoud morfologie
• Behoud van de complexiteit die in vivo gevonden wordt (bv. tumor heterogeniciteit)
• Je kan dat maken van tumorcellen en gezond weefsel à sterkte
• Longcel opkweken in het lab à funcOonele cellen collecteren
• Door te spelen met verschillende groeifactoen kunnen we stamcellen laten differenOëren à
heterogene, funcOonele celpopulaOe
• Biobank van organoiden à veel representaOever
- UZA à organoide biobank à labo à bewerken om het terug tot single cell niveau te
brengen à terug in een druppeltje laten groeien = organoïde
- Ze kunnen nu onderzoek doen op 3D kankers van paOënten à behandelen: je ziet vaak
organoïden die resistent zijn of ongevoelig = heel belangrijk voor
behandelingsonderzoek
• Genomische, transcriptomische,... karakterisOeken worden behouden
• Die kunnen zichzelf organiseren à behoud van morfologie
• Behoud van de complexiteit die in vivo gevonden wordt (bv. tumor heterogeneciteit)
• Organoiden van de hersenen
• Moeilijker dan het kweken van kankercellijnen
- Medium is heel tumoraqankelijk
- Gebaseerd op de acOvaOe van de Wnt/B-catenin pathway
- Noggin: inhibiOe BMP signaling
- Groeifactoren zoals EGF, FGF2, FGF7, FGF10
- B27 en N2s upplementen
- Rock inhibitor à gaat bepaalde pathway inacOveren à op die manier gaan cellen die
alleen zijn toch overleven
- AnObioOca
- …
à Heel veel trial and error
• Oncologisch onderzoek op cellen, 2D culturen à muizen à kliniek
• Toenemende druk om in vivo onderzoek te limiteren (ethisch)
- FDA bepaalt of een bepaalde drug in de kliniek mag gebruikt worden of een bepaalde
drug verkocht mag worden à vroegen data van muizen à nu is er een act opgesteld
dat toelaat dat er meer geavanceerde modellen ook gebruikt mogen worden
- Slide 2: Sinds deze maand 3.0 à flexibeler om voor bepaalde behandelingsgroepen
muizen volledig te excluderen en te vervangen door bepaalde een aantal pijlers
Tumor micro-omgeving (TME)
• Focus op in vitro modellen, 2D culturen
• Maar kanker is niet alleen à TME: fibroblasten, immuuncellen, epitheelcellen à voeden mee
de kankercellen
- Kunnen ervoor zorgen dat bepaalde therapieën niet gaan werken
- Hoe representaOef is het om te werken met organoïden?
• Pancreascellen zijn omringd door de micro-omgeving: macrofagen, immuuncellen,
lymfocyten, bindweefselcellen (à gaan ECM uitscheiden), endotheelcellen
• Heel lang gebeurt er onderzoek met 2D modellen à niet representaOef voor paOënt
• Cellen communiceren met elkaar
- Paracriene interacOe: uitscheiden van factoren om cellen te acOveren
o Bv. uitscheiden van groeifactoren door fibroblasten die kankergroei promoten.
o paracrien: bepaalde groeifactoren worden uitgescheiden à binden op
receptoren à acOveren van pathways: ongecontroleerde groei, of resistenOe
tegen therapieën
- Direct celcontact: directe communicaOe tussen cellen
o Bv. fibroblasten die een stromaal schild vormen rond pancreas kankercellen en
deze afschermen van therapieën
• Voedingsstof gradiënt
- Tumorcellen groeien zo snel à bloedvaten kunnen niet volgen à hypoxische
omgeving à kankercellen kunnen zich aanpassen à hierdoor minder gevoelig aan
bepaalde therapieën
- Hypoxie
o AcOvaOe van bv. HIF1alpha
o Invloed op groei, metabolisme, therapierespons
In vitro kankermodellen
Tradi&onele modellen
• Kankercellijnen
- Commercieel beschikbaar
- Nadelen: homogene populaOe (tumor = heterogeen), geneOcdri\ (accumulaOe van
nieuwe mutaOes), beperkte correlaOe met tumor in paOënt
o Van paOënten afgeleid, al heel lang à hoe representaOef voor de kanker die
in de paOënt is gevonden
- Voordelen: meerdere kankercellijnen per tumortype beschikbaar (± 20), zeer goed
gekarakteriseerd (genoom, transcriptome, gevoeligheid voor hele reeks therapieën
reeds bepaald), geïmortaliseerd
, • 2D culturen
- Nadeel: gemiste contact met ECM en cel-cel interacOes, veranderingen van morfologie
en transcriptoom, acOvaOe of inacOvaOe van pathways, geen zuurstof en
voedingsstoffen gradiënt, weinig representaOef voor in vivo TME (hierdoor falen veel
van deze drugs in de kliniek)
- Voordeel: eenvoudig/gestandaardiseerd,reproduceerbaar,goedkoop
3D modellen
• Voordelen: rechtstreeks cel contact wordt behouden + cel-matrix contact, zuurstof en
voedingsstoffen gradiënt, interacOe tussen cellen, co-culturen, recreëren van TME,
mogelijkheid om vascularisaOe en bloedtoevoer na te bootsen
- Platen behandelen met coaOng waardoor cellen niet kunnen binden aan het
oppervlak, maar wel aan elkaar à cel-cel interacOes
• Nadeel: nieuwe protcols implementeren, specifieke know-how vereist, moeilijker om te
analyseren, duurder, reproduceerbaarheid, low throughput
• Scaffold/matrix based
- Extracellulaire matrix (ECM)
- Ontwikkeling van scaffold/hydrogels die ECM nabootsen
- Animal-based: afgeleid, matrigel (> 30 jaar) van muis sarcomacellen
o Bevat collageen, laminine, groeifactoren… (groeifactoren = niet alOjd een
voordeel)
o Nadeel: ethisch (animal-derived), batch-to-batch variability (groeifactoren die
erin zicen zijn niet alOjd goed gekarakteriseerd = variabiliteit), acOvaOe van
immuuncellen (adomsOg van muis immers), verhard bij kamertemperatuur
à koeling nodig,
- Plant-based
o Van cellulose bijvoorbeeld
o Voordeel: gemakkelijker om te gebruiken in het lab, want het is verhard bij
37°C, consistente batches, beter gedefinieerd
- Voorbeelden mulO-spheroid applicaOes
o Ingebedde mulO-spheroiden in 96-well voor drug screening
o Soms migreren de cellen uit de druppel à 2D ook te zien
o AlOjd startende van de matrix waarin je de cellen laat groeien
o Hoe ‘zij’ het meestal doen à in druppeltjes
§ Zie rechts slide 10: verschillende organoïden
à Hier ook 2D: kanker is heel aggressief en gaat binden op het
oppervlak
• Scaffold free
- Meer mechanische methoden om de cellen te sOmuleren om samen te komen
- Single spheroid
- Ultra-low acachment coaOng (ULA)
- Round-bocom microplates
- Hanging-dropmethod
• Tumor-on-a-chip
- Geavanceerder à tumor-on-a-chip is de meest complexe methode
- Kleine chips waar dat je in verschillende zones verschillende soorten cellen kan laten
groeien = microfluids
- InteracOe tussen bloedcellen en kankercellen laten nabootsen
- ComparOmenten met verschillende fysiologische condiOes of cellen
- Complexe analyse en low-throughput
, - Voordeel: relevanter, verschillende organen combineren
- Nadeel: technologische experOse, en analyse daarvan is vaak moeilijk en Ojdrovend
• 3D bioprinten
- Scaffold/hydrogel al dan niet met cellen
- Printen van complexe restructuren
- In combinaOe met chip technologie
Pa&ent afgeleide organoiden
• Organoïden zijn inniOeel ontstaan om organen te kweken in het lab om te zien uit welke
weefsels een orgaan ontstaat
• Kweken van ex vivo paOënt afgeleide tumoren of gezonde organen in 3D
- Celijn is afgeleid van een paOënt à zolang gegroei dat die geïmmortaliseerd is
• MulOcellulaire structuren afgeleid van (kanker)stamcellen
• Behoud genomische, transcriptomische,… karakterisOeken
• DifferenOaOe cellen à heterogene, funcOonele celpopulaOe (bij organoïden afgeleid van
gezond weefsel)
• Self-organising à behoud morfologie
• Behoud van de complexiteit die in vivo gevonden wordt (bv. tumor heterogeniciteit)
• Je kan dat maken van tumorcellen en gezond weefsel à sterkte
• Longcel opkweken in het lab à funcOonele cellen collecteren
• Door te spelen met verschillende groeifactoen kunnen we stamcellen laten differenOëren à
heterogene, funcOonele celpopulaOe
• Biobank van organoiden à veel representaOever
- UZA à organoide biobank à labo à bewerken om het terug tot single cell niveau te
brengen à terug in een druppeltje laten groeien = organoïde
- Ze kunnen nu onderzoek doen op 3D kankers van paOënten à behandelen: je ziet vaak
organoïden die resistent zijn of ongevoelig = heel belangrijk voor
behandelingsonderzoek
• Genomische, transcriptomische,... karakterisOeken worden behouden
• Die kunnen zichzelf organiseren à behoud van morfologie
• Behoud van de complexiteit die in vivo gevonden wordt (bv. tumor heterogeneciteit)
• Organoiden van de hersenen
• Moeilijker dan het kweken van kankercellijnen
- Medium is heel tumoraqankelijk
- Gebaseerd op de acOvaOe van de Wnt/B-catenin pathway
- Noggin: inhibiOe BMP signaling
- Groeifactoren zoals EGF, FGF2, FGF7, FGF10
- B27 en N2s upplementen
- Rock inhibitor à gaat bepaalde pathway inacOveren à op die manier gaan cellen die
alleen zijn toch overleven
- AnObioOca
- …
à Heel veel trial and error
