Samenvatting moleculaire biologie
DNA-isolatie
2.1 What is cloning?
De definitie van kloneren is het gebruik maken van ongeslachtelijke voorplanting om organismen te
krijgen die genetisch identiek aan elkaar zijn, en identiek aan de
‘ouders’. Het feitelijke uiterlijk en gedrag kan worden beïnvloed door
anderen factoren, zoals hun omgeving. Dit geldt voor alle organismen,
van bacteriën tot mecansen.
De term kloneren wordt toegepast op genen. Als je een vreemd gen in
een bacterie inbrengt, of in ander type cel, en je doet dit op een
manier dat het gen wordt gekopieerd wanneer de cel repliceert, dan
produceer je een groot aantal cellen met precies dezelfde kopies van
het DNA, dan heb je dat gen gekloneerd. Door op deze manier talloze
kopieën te maken kan het stukje DNA gesequenced worden
(nucleotide volgorde bepalen) of kan het stukje DNA gelabeld worden
en op deze manier gekeken worden hoe het tot expressie komt in het
organisme. Zie figuur 2.1
2.2 Overview of the procedures
Er zijn sommige bacteriën die van nature DNA opnemen doormiddel van een proces dat
transformatie is genoemd. Echter, moeten de meeste bacteriën een chemische of fysische
behandeling ondergaan voordat het DNA de cel binnendringt. In alle gevallen zal het DNA niet
worden gerepliceerd door de gastheercel, tenzij het ofwel recombineert met het
gastheerchromosoom, of als alternatief wordt opgenomen in een molecuul die door de gastheer
wordt herkend als een substraat voor replicatie. Er wordt een vector gebruikt om het DNA te dragen
en te repliceren. Er zijn heel veel vectoren, zoals plasmiden. Plasmiden zijn natuurlijk voorkomende
stukjes DNA die onafhankelijk van het chromosoom worden gerepliceerd en
worden geërfd door de twee dochtercellen wanneer de cel zich deelt. Later
worden nog twee vectors besproken zoals bacteriophagen.
Het DNA dat we willen klonen, wordt ingebracht in een geschikte vector, het
produceren van een recombinant molecuul dat bestaat uit vector plus insert. Dit
recombinant molecuul wordt gerepliceerd door een bacteriële cel, zodat alle
cellen die afstammen van het oorspronkelijke transformant een kopie van dit
stukje recombinant DNA zullen bevatten. Een bacterie zoals E.coli deelt heel erg
snel waardoor je na enkele uren een heel groot aantal bacteriën hebt met het
gekloonde DNA. Deze exponentiële groei gaat niet oneindig door, dit kan komen
doordat de voedingstoffen op raken die de bacterie nodig heeft om te
vermenigvuldigen. Evenzo als we de bacteriën zover kunnen krijgen dat ze het
gekloonde gen tot expressie kunnen brengen, kunnen we ook relatief gemakkelijk zeer grote
hoeveelheden van het product van dat gen krijgen.
Om een stukje DNA in een vector te plaatsen, is er een methode nodig die stukjes
DNA met elkaar kan verbinden, net als een manier om de vector te knippen om een
mogelijk te bieden om verbinden tussen vector en insert-DNA te laten plaats
vinden. Een grote ontdekking was dat enzymen dit beide konden. De belangrijkste
enzymen die nodig zijn, zijn restrictie-endonucleasen, die de suiker-fosfaat
backbone van DNA moleculen breken op precieze plekken, en DNA-ligases, die
kunnen de DNA fragmenten aan elkaar verbinden die zijn gevormd.
,Wanneer het stukje DNA is ingebracht bij het plasmide vector (een recombinant plasmiden) kan het
in een bacteriële gastheer worden ingebracht doormiddel van transformatie. Over het algemeen is
dit niet heel erg efficiënt omdat maar een klein deel van de bacteriën een plasmiden opnemen.
Echter wanneer een plasmiden vector wordt gebruikt dat een gen draagt dat codeert voor de
resistentie tegen een specifiek antibiotica, kunnen we simpelweg de getransformeerde bacterie
cultuur op een agar plaat uitstrijken dat dat specifieke antibiotica bevat.
2.3 Extraction and purification of nucleic acids
De eerste stap voor de processen die in dit boek worden besproken is het DNA uit de cel te
extraheren en het te zuiveren door het te scheiden van andere cellulaire componenten. Als we
beginnen met een kweek van bacteriële of eukaryote cellen, is de eerste stap het scheiden van de
cellen van het groeimedium, door bijvoorbeeld centrifugeren. De cellen moeten vervolgens worden
gelyseerd om hun componenten vrij te maken. Een typische bacteriële cel wordt omsloten door een
cytoplasmatisch membraan en omgeven door een stijve celwand. Om een bacteriële cellen te lyseren
is dus een combinatie van relatief agressieve chemicaliën nodig; voor E.coli kan cellysis worden
bereikt door combinatie van EDTA, lysozym en een detergens zoals SDS. Een voordeel van het
gebruik van EDTA is dat het DNases remt die anders de neiging zouden hebben om het DNA dat we
willen isoleren af te breken.
Planten- en schimmelcellen hebben celwanden die anders zijn dan die in bacteriën, deze vereisen
dan ook alternatieve behandelingen, dit kan mechanisch of enzymatisch.
Het resterende ruwe extract van deze lysis bevat een complex mengsel van DNA, RNA, eiwitten,
lipiden en koolhydraten. De lysis kan er voor zorgen dat ook het chromosomale DNA wordt
gefragmenteerd, dit moet worden voorkomen, om dit te voorkomen zijn zachtere lysis-
omstandigheden nodig waarbij het chromosoom niet kapot gaat. De volgende stap is om het
gewenste nucleïnezuur te scheiden van de andere componenten. Verwijdering van een RNA uit een
DNA-preparaat wordt gemakkelijk bereikt door behandeling met ribonuclease (RNase). Om uit een
RNA-preparaat DNA te verwijderen kan er weer DNase worden gebruikt. Verwijdering van eiwitten is
bijzonder belangrijk omdat de cel een aantal enzymen bevat die nucleïnezuren zullen afbreken,
evenals eiwitten die de daaropvolgende procedures zullen verstoren door te binden aan
nucleïnezuren. De meest effectieve manier om eiwitten te verwijderen is door extractie met een
mengsel van vloeibaar gemaakt fenol en chloroform. Nu is er een eiwitvrij monster en moet het
monster geconcentreerd worden. Dit word gedaan door isopropanol of ethanol, hierdoor vind er
nucleïnezuurneerslag plaats. Verder kan er nog gescheiden worden door middel van alkalische
denaturatie (plasmide te scheiden van het chromosomale DNA door verandering van de pH) en
kolomzuivering (zuiveren van nucleïnezuren, door verschil in grootte.).
DNA-analyse
2.4 Detection and quantitation of nucleic acids
Wanneer je DNA preparaat redelijk zuiver is kan je de concentratie DNA bepalen door de absorptie te
meten in een UV spectrofotometer bij 260nm. UV absorptie geeft geen controle op de integriteit van
je DNA; het kan compleet gedegradeerd zijn en nog steeds een uitkomst geven. De absorptie bij
280nm wordt gebruikt om de verontreiniging te beoordelen, hierbij wordt de verhouding 260 : 280
gebruikt. Wanneer de uitkomst tussen de 1,75 en 2 ligt kan het monster als redelijk zuiver worden
beschouwd. 280nm is de golflengte waarbij eiwitten absorberen.
, Stoffen zoals ethidiumbromide worden gewoonlijk gebruikt voor zowel detectie en kwantificering
van nucleïnezuren. Ehtidiumbromide heeft een platte ring structuur die tussen de basen in
nucleïnezuren kan stapelen; dit staat bekend als intercalation (tussenvoeging). De kleurstof kan
worden gedetecteerd door zijn fluorescentie wanneer het wordt blootgesteld aan UV. Dit is de meest
gebruikte methode voor de kleuring van elektroforese gels, en kan ook gebruikt worden voor de
bepaling van de hoeveelheid DNA in elk bandje op de gel, door de intensiteit van de fluorescentie te
vergelijken met een bandje waar de concentratie van bekend is op dezelfde gel.
2.5 Gel electrophoresis
Gel elektroforese is een noodzakelijke techniek voor zowel de analyse als de zuivering van
nucleïnezuren. Wanneer een geladen molecuul wordt geplaatst in een elektrisch veld, zal het
migreren naar de elektrode met de tegenovergestelde lading. DNA en RNA zijn negatief geladen en
zullen zich dus verplaatsen naar de positieve kant. In een gel bestaat uit een complex netwerk van
poriën, de snelheid waarmee een nucleïnezuur zich beweegt wordt bepaald door de mogelijkheid om
het netwerk te doordringen. De effectieve range grote van de nucleotiden dat een gel kan scheiden is
bepaald door de gel zijn samenstelling. Er kan een agarose gel gebruikt worden voor het scheiden
van nucleïnezuren groter dan een aantal honderd basenparen, het verminderen van de concentratie
agarose om grotere fragmenten te scheiden op een effectieve manier, of het verhogen voor de kleine
fragmenten. Voor enkele tientallen basenparen kan een polyacrylamide gel worden gebruikt. Deze
gels zijn in staat DNA-ketens te onderscheiden met slechts een verschil in lengte van een enkele
base.
2.5.1 Analytical gel electrophoresis
Er kan gebruikt worden gemaakt van een agarose gel om de samenstelling en
kwaliteit van een nucleïnezuur te analyseren. Om de grote van DNA
fragmenten te bepalen van een PCR product of restrictie digestie, is het
noodzakelijk om de gel te kalibreren door een marker te runnen met bekende
grootte van de fragmenten. Dit is in figuur 2.6 weergegeven. Er is een lineair
verband tussen de logaritmen van de grootte van het fragment en de afstand
dat het fragment heeft afgelegd op de gel. Met de kalibratie kan je de grootte
van en onbekend fragment bepalen. Hierbij wordt er wel vanuit gegaan dat
het een lineair dubbel-strengs DNA fragment is.
De reden waarom grotere DNA moleculen geen lineaire curve hebben is
omdat deze moleculen op een andere manier door de gel bewegen. Ze zijn
heel groot, maar ook heel erg dun, en ze kunnen in feite door het uiteinde van de gel glijden. Het
duurt een poosje voordat ze in een rij staan, maar wanneer ze dat eenmaal zijn, dan is de snelheid
waarmee ze bewegen grotendeels afhankelijk van hun grote. Speciale technieken waarbij gebruikt
wordt gemaakt van het regelmatig wisselen van de richting van het elektrische veld zijn te gebruiken
voor het scheiden van hele grote DNA moleculen.
als een meer nauwkeurige bevestiging van de aard van het monster vereist is, wordt de gel op een
membraandrager geblot en gehybridiseerd met een nucleïnezuur probe.
Niet alle DNA moleculen zijn lineair. Oorspronkelijke
plasmiden zijn supercoilde circulaire moleculen, maar
als een plasmide nicked is, zijn de losse uiteinden vrij
om te draaien, en het neemt dan een open circulaire
vorm aan. Daarnaast en double-strand breuk zal een
gelineariseerde plasmiden produceren. Het is daarom
DNA-isolatie
2.1 What is cloning?
De definitie van kloneren is het gebruik maken van ongeslachtelijke voorplanting om organismen te
krijgen die genetisch identiek aan elkaar zijn, en identiek aan de
‘ouders’. Het feitelijke uiterlijk en gedrag kan worden beïnvloed door
anderen factoren, zoals hun omgeving. Dit geldt voor alle organismen,
van bacteriën tot mecansen.
De term kloneren wordt toegepast op genen. Als je een vreemd gen in
een bacterie inbrengt, of in ander type cel, en je doet dit op een
manier dat het gen wordt gekopieerd wanneer de cel repliceert, dan
produceer je een groot aantal cellen met precies dezelfde kopies van
het DNA, dan heb je dat gen gekloneerd. Door op deze manier talloze
kopieën te maken kan het stukje DNA gesequenced worden
(nucleotide volgorde bepalen) of kan het stukje DNA gelabeld worden
en op deze manier gekeken worden hoe het tot expressie komt in het
organisme. Zie figuur 2.1
2.2 Overview of the procedures
Er zijn sommige bacteriën die van nature DNA opnemen doormiddel van een proces dat
transformatie is genoemd. Echter, moeten de meeste bacteriën een chemische of fysische
behandeling ondergaan voordat het DNA de cel binnendringt. In alle gevallen zal het DNA niet
worden gerepliceerd door de gastheercel, tenzij het ofwel recombineert met het
gastheerchromosoom, of als alternatief wordt opgenomen in een molecuul die door de gastheer
wordt herkend als een substraat voor replicatie. Er wordt een vector gebruikt om het DNA te dragen
en te repliceren. Er zijn heel veel vectoren, zoals plasmiden. Plasmiden zijn natuurlijk voorkomende
stukjes DNA die onafhankelijk van het chromosoom worden gerepliceerd en
worden geërfd door de twee dochtercellen wanneer de cel zich deelt. Later
worden nog twee vectors besproken zoals bacteriophagen.
Het DNA dat we willen klonen, wordt ingebracht in een geschikte vector, het
produceren van een recombinant molecuul dat bestaat uit vector plus insert. Dit
recombinant molecuul wordt gerepliceerd door een bacteriële cel, zodat alle
cellen die afstammen van het oorspronkelijke transformant een kopie van dit
stukje recombinant DNA zullen bevatten. Een bacterie zoals E.coli deelt heel erg
snel waardoor je na enkele uren een heel groot aantal bacteriën hebt met het
gekloonde DNA. Deze exponentiële groei gaat niet oneindig door, dit kan komen
doordat de voedingstoffen op raken die de bacterie nodig heeft om te
vermenigvuldigen. Evenzo als we de bacteriën zover kunnen krijgen dat ze het
gekloonde gen tot expressie kunnen brengen, kunnen we ook relatief gemakkelijk zeer grote
hoeveelheden van het product van dat gen krijgen.
Om een stukje DNA in een vector te plaatsen, is er een methode nodig die stukjes
DNA met elkaar kan verbinden, net als een manier om de vector te knippen om een
mogelijk te bieden om verbinden tussen vector en insert-DNA te laten plaats
vinden. Een grote ontdekking was dat enzymen dit beide konden. De belangrijkste
enzymen die nodig zijn, zijn restrictie-endonucleasen, die de suiker-fosfaat
backbone van DNA moleculen breken op precieze plekken, en DNA-ligases, die
kunnen de DNA fragmenten aan elkaar verbinden die zijn gevormd.
,Wanneer het stukje DNA is ingebracht bij het plasmide vector (een recombinant plasmiden) kan het
in een bacteriële gastheer worden ingebracht doormiddel van transformatie. Over het algemeen is
dit niet heel erg efficiënt omdat maar een klein deel van de bacteriën een plasmiden opnemen.
Echter wanneer een plasmiden vector wordt gebruikt dat een gen draagt dat codeert voor de
resistentie tegen een specifiek antibiotica, kunnen we simpelweg de getransformeerde bacterie
cultuur op een agar plaat uitstrijken dat dat specifieke antibiotica bevat.
2.3 Extraction and purification of nucleic acids
De eerste stap voor de processen die in dit boek worden besproken is het DNA uit de cel te
extraheren en het te zuiveren door het te scheiden van andere cellulaire componenten. Als we
beginnen met een kweek van bacteriële of eukaryote cellen, is de eerste stap het scheiden van de
cellen van het groeimedium, door bijvoorbeeld centrifugeren. De cellen moeten vervolgens worden
gelyseerd om hun componenten vrij te maken. Een typische bacteriële cel wordt omsloten door een
cytoplasmatisch membraan en omgeven door een stijve celwand. Om een bacteriële cellen te lyseren
is dus een combinatie van relatief agressieve chemicaliën nodig; voor E.coli kan cellysis worden
bereikt door combinatie van EDTA, lysozym en een detergens zoals SDS. Een voordeel van het
gebruik van EDTA is dat het DNases remt die anders de neiging zouden hebben om het DNA dat we
willen isoleren af te breken.
Planten- en schimmelcellen hebben celwanden die anders zijn dan die in bacteriën, deze vereisen
dan ook alternatieve behandelingen, dit kan mechanisch of enzymatisch.
Het resterende ruwe extract van deze lysis bevat een complex mengsel van DNA, RNA, eiwitten,
lipiden en koolhydraten. De lysis kan er voor zorgen dat ook het chromosomale DNA wordt
gefragmenteerd, dit moet worden voorkomen, om dit te voorkomen zijn zachtere lysis-
omstandigheden nodig waarbij het chromosoom niet kapot gaat. De volgende stap is om het
gewenste nucleïnezuur te scheiden van de andere componenten. Verwijdering van een RNA uit een
DNA-preparaat wordt gemakkelijk bereikt door behandeling met ribonuclease (RNase). Om uit een
RNA-preparaat DNA te verwijderen kan er weer DNase worden gebruikt. Verwijdering van eiwitten is
bijzonder belangrijk omdat de cel een aantal enzymen bevat die nucleïnezuren zullen afbreken,
evenals eiwitten die de daaropvolgende procedures zullen verstoren door te binden aan
nucleïnezuren. De meest effectieve manier om eiwitten te verwijderen is door extractie met een
mengsel van vloeibaar gemaakt fenol en chloroform. Nu is er een eiwitvrij monster en moet het
monster geconcentreerd worden. Dit word gedaan door isopropanol of ethanol, hierdoor vind er
nucleïnezuurneerslag plaats. Verder kan er nog gescheiden worden door middel van alkalische
denaturatie (plasmide te scheiden van het chromosomale DNA door verandering van de pH) en
kolomzuivering (zuiveren van nucleïnezuren, door verschil in grootte.).
DNA-analyse
2.4 Detection and quantitation of nucleic acids
Wanneer je DNA preparaat redelijk zuiver is kan je de concentratie DNA bepalen door de absorptie te
meten in een UV spectrofotometer bij 260nm. UV absorptie geeft geen controle op de integriteit van
je DNA; het kan compleet gedegradeerd zijn en nog steeds een uitkomst geven. De absorptie bij
280nm wordt gebruikt om de verontreiniging te beoordelen, hierbij wordt de verhouding 260 : 280
gebruikt. Wanneer de uitkomst tussen de 1,75 en 2 ligt kan het monster als redelijk zuiver worden
beschouwd. 280nm is de golflengte waarbij eiwitten absorberen.
, Stoffen zoals ethidiumbromide worden gewoonlijk gebruikt voor zowel detectie en kwantificering
van nucleïnezuren. Ehtidiumbromide heeft een platte ring structuur die tussen de basen in
nucleïnezuren kan stapelen; dit staat bekend als intercalation (tussenvoeging). De kleurstof kan
worden gedetecteerd door zijn fluorescentie wanneer het wordt blootgesteld aan UV. Dit is de meest
gebruikte methode voor de kleuring van elektroforese gels, en kan ook gebruikt worden voor de
bepaling van de hoeveelheid DNA in elk bandje op de gel, door de intensiteit van de fluorescentie te
vergelijken met een bandje waar de concentratie van bekend is op dezelfde gel.
2.5 Gel electrophoresis
Gel elektroforese is een noodzakelijke techniek voor zowel de analyse als de zuivering van
nucleïnezuren. Wanneer een geladen molecuul wordt geplaatst in een elektrisch veld, zal het
migreren naar de elektrode met de tegenovergestelde lading. DNA en RNA zijn negatief geladen en
zullen zich dus verplaatsen naar de positieve kant. In een gel bestaat uit een complex netwerk van
poriën, de snelheid waarmee een nucleïnezuur zich beweegt wordt bepaald door de mogelijkheid om
het netwerk te doordringen. De effectieve range grote van de nucleotiden dat een gel kan scheiden is
bepaald door de gel zijn samenstelling. Er kan een agarose gel gebruikt worden voor het scheiden
van nucleïnezuren groter dan een aantal honderd basenparen, het verminderen van de concentratie
agarose om grotere fragmenten te scheiden op een effectieve manier, of het verhogen voor de kleine
fragmenten. Voor enkele tientallen basenparen kan een polyacrylamide gel worden gebruikt. Deze
gels zijn in staat DNA-ketens te onderscheiden met slechts een verschil in lengte van een enkele
base.
2.5.1 Analytical gel electrophoresis
Er kan gebruikt worden gemaakt van een agarose gel om de samenstelling en
kwaliteit van een nucleïnezuur te analyseren. Om de grote van DNA
fragmenten te bepalen van een PCR product of restrictie digestie, is het
noodzakelijk om de gel te kalibreren door een marker te runnen met bekende
grootte van de fragmenten. Dit is in figuur 2.6 weergegeven. Er is een lineair
verband tussen de logaritmen van de grootte van het fragment en de afstand
dat het fragment heeft afgelegd op de gel. Met de kalibratie kan je de grootte
van en onbekend fragment bepalen. Hierbij wordt er wel vanuit gegaan dat
het een lineair dubbel-strengs DNA fragment is.
De reden waarom grotere DNA moleculen geen lineaire curve hebben is
omdat deze moleculen op een andere manier door de gel bewegen. Ze zijn
heel groot, maar ook heel erg dun, en ze kunnen in feite door het uiteinde van de gel glijden. Het
duurt een poosje voordat ze in een rij staan, maar wanneer ze dat eenmaal zijn, dan is de snelheid
waarmee ze bewegen grotendeels afhankelijk van hun grote. Speciale technieken waarbij gebruikt
wordt gemaakt van het regelmatig wisselen van de richting van het elektrische veld zijn te gebruiken
voor het scheiden van hele grote DNA moleculen.
als een meer nauwkeurige bevestiging van de aard van het monster vereist is, wordt de gel op een
membraandrager geblot en gehybridiseerd met een nucleïnezuur probe.
Niet alle DNA moleculen zijn lineair. Oorspronkelijke
plasmiden zijn supercoilde circulaire moleculen, maar
als een plasmide nicked is, zijn de losse uiteinden vrij
om te draaien, en het neemt dan een open circulaire
vorm aan. Daarnaast en double-strand breuk zal een
gelineariseerde plasmiden produceren. Het is daarom
