Samenvatting-Celcultuur en immunochemie

CELCULTUUR EN
IMMUNOCHEMIE
HOODSTUK I: INLEIDING

GESCHIEDENIS

Doorbraak in celculturen zo’n 100 jaar geleden (1950) door 3 belangrijke ontdekkingen:

1) Antibiotica: besmetting voorkomen bij celkweek  voor 1950: bacteriën overgroeide weefsel
omdat ze sneller groeien
2) Trypsine: cellen losmaken van cultuurflessen
3) Chemisch gedefinieerde cultuurmedia (vaste hoeveelheden glucose, eiwitten, …)  voor 1950:
werd bloed gebruikt = geen ideaal medium (elk bloed is verschillend)



 Heeft een kikker gebruikt want het is koud bloedig
 Delings tijd van een bacterie  40 minuten
 Glucose, aminozuren er bij zo dat jou weefsel sneller gaat groeien
 JAREN moeten wij niet kennen maar wel periodes


Celcultuur = essentieel in biomedisch onderzoek:

Opbouw virus: RNA of DNA omgeven door nucleocapside (= eiwitmantel) virussen hebben spikes om
zich aan de receptoren van cellen te hechten  virus dringt vervolgens in cel om zich te
vermenigvuldigen

2 soorten virussen:

- Naakt virus: spikes (= glycoproteïnen) zitten op de eiwit mantel bv: polio
- Enveloppe virus: envelop (= celmembraan) zit rond de nucleocapside  op de eveloppe zitten
de spikes

Virus = obligaat intracellulair  virus heeft cellen nodig om zich te vermenigvuldigen


POLIO VIRUS (1940-1957)
- Kinder verlamming
- Moeilijk ademen
- Pandemie
2 soorten vaccin tegen polio
- Formaline geïnactiveerd vaccin
 Formaline zorgt ervoor dat de structuur van het levend infectieus virusdeeltje
behoudenvwordt, zodat het lichaam juist reageert + formaline inactiveert het
virus zodat het geen ziekte kan verwekken maar wel het immuunsysteem
activeert
- Levend verzwakt polio vaccin
 Van virusdeeltjes in het labo (soms betere immuunrespons)

,  Enkel in ideale omgevingen van het labo
 Ze zijn niet meer virulent
 Er bestaan soms verzwakt mutanten dat je dan gebruikt als vaccin
1) Cultuurfles: cultuurmedium + cellen die zich onderaan in de fles vasthechten  cellen
vermenigvuldigen zich en vormen een monolaag
2) Virusdeeltje toedienen aan cellen  virus vermenigvuldigt zich en infecteert alle cellen
3) Virusdeeltje wordt overgebracht naar een nieuwe cultuurfles  vermenigvuldigt zich
opnieuw

Bij de vermenigvuldiging ontstaan soms verzwakte mutanten  deze worden in het vaccin gebruikt


HELA CELLS
- Had baarmoederhalskanker veroorzaakt door HPV
- Had haar cellen genomen wanneer ze overleden was en wordt nu nog altijd gebruikt voor
onderzoek
- Kankercellen groeien heel snel  maar nadeel contaminatie, celcultuur van de luchtwegen
bij voorbeeld worden dan gecontamineerd met hela cellen dus op een duur heb je gewoon
hela cellen


HYBRIDOMA-TECHNOLOGIE (1975)
= technologie die het toelaat om cellen continu monoklonale antilichamen te laten produceren

- Muis en antigen  wil je graag een antilichaam tegen
- Uit de milt ga je b-cellen isoleren  en ga je ze kweken maar na een tijd gaan die B cellen
beginnen af te sterven
Oplossing  normale b cellen laten fusioneren met een tumorale cel of een continue
cel
- Bij de cellen voegen wij PEG toe  bevordert de fusie
- De gene die binden met het antigeen blijft  hybridoma

Hybridoma = cel die ontstaat door de fusie van een B-lymfocyt met een kankercel (myeloma)  cel
heeft oneindige levensduur (van myeloma) en produceert antilichamen (B-lymfocyt)


CEL EN WEEFSELTECHNOLOGIE
Doel = verkrijgen van (bio)implantaten om uitgevallen of slechtwerkende organen en weefsels te
ondersteunen of vervangen bv: skingrafting

- Door diabetes  veel amputaties
- Wonden genezen heel traag
Oplossing  Cellen met polymeren  op wonde doen dus versnelt de genezing
 Type I diabetes
- Transplantatie van de pancreas  maar door de transplantatie veel van de cellen werken
niet meer

Diabetes: weefsels implanteren waarvan de cellen genetisch zijn aangepast zodat ze kunnen dienen voor
de geregelde afgifte van insuline

,VOORDELEN

 Controleren van de omgeving
o Fysiologische parameters  altijd het zelfde medium  resultaten normaal gezien
altijd wel gelijkaardig
o Fysiochemische parameters
 21% zuurstof
 0,03% CO2
 pH 7,4
 temperatuur 37
o Fysiologische parameters
 Voedingstoffen % serum, medium
Isotoom  evenveel deeltjes binnen als buiten de cel
 0,9% NaCl

Maar: meeste cellijnen hebben nood aan media, gesupplementeerd met serum. Dit is nadelig want
serum is gevoelig aan lotvariatie en bevat ongedefinieerde elementen (hormonen)

 Geode karakterisatie en homogeniteit
o Meest weefsel culturen  homogeen
o Door subcultivatie neemt neemt de homogeniteit toe
- De cellen bij elke transfer gemengd worden
- Er onder invloed van cultuuromstandigheden een selectie plaats vindt van
één welbepaald celtype
o Na verloop van de tijd ontstaan er mutaties  belangrijk om om een goed
karakteristieke cellijn in te vriezen als cryostock
o Passeren  cellen over brengen van de ene fles naar de andere zodat ze kunnen
blijven groeien
Vorming van een monolaag  cellen kunnen niet meer groeien dus ze gaan afsterven,
dus voor dat wij die monolaag hebben moeten wij die cellen los maken met trypsine
o Een deel van de cellen ga je gebruiken om de cylcus te gebruiken
o De andere cellen kan je gebruiken voor experimenten
o Hoe meer dat je normale cellen passeert hoe ouder dat jou cellen wordt
o Met continue cellen moet je opletten voor mutaties
o Jou cellen komen van een weefsel  kweken en de cylcus laten doen maar je ga zo
snel mogelijk een deel van de cellen invriezen = cryostock
Bewaren in vloeibare stikstof (als je dat niet doet dan naar een tijd heb je geen cellen
meer)
 Kostprijs
o Miniaturisatie (microliter-niveau) en afwezigheid van excretiemechanismen zorgen
ervoor dat voor het onderzoek slechts kleine hoeveelheden monster en reagentia
nodig zijn
o Aankoop en onderhoud van proefdieren is duur. Over het gebruik van dieren voor
proeven  ethische vragen wat niet zo is bij cel- en weefselcultuur

, NADELEN

(op het examen kan hij nadelen geven en dan moet je alternatieven kunnen geven)

 Expertise
o werken in strikt aseptische (steriele) omstandigheden  want dierlijke cellen groeien
trager dan meeste bacteriën en schimmels
o Ze doen antibiotica in jou medium zo dat je geen besmettingen hebt (bij ons maar bij
experten doen ze dat niet)
 Hoeveelheden
o De hoeveelheden dat kunnen gekweekt worden op laboschaal  ordegrootte van 109
o Grotere hoeveelheden moeten op industriële schaal gekweekt worden  grotere
kosten en problemen
 Instabiliteit
o Probleem zowel voor normale als continue cellen
o Normale cellen  beperkte levensduur  verlies van gedifferentieerde
eigenschappen  cellen stoppen met delen en sterven = senescentie
o Continue cellen hebben een aneuploïdie  instabiel aantal chromosomen
o Cellen groeien twee dimensionaal, tumor cellen groeien drie dimensionaal
 Als je dichter bij de patiënt wilt gaan moet je eigenlijk bijna driedimensionaal
gaan
 Cultuuromgeving versus in vivo
o Tweedimensionale in cultuuromgeving – driedimensionaal in vivo
 Cel-cel en cel-matrix interacties verdwijnen in vitro
 Cellen zijn beweegelijk
 Snelle celdeling  ze krijgen het beste medium om te groeien maar ons
lichaam (in vivo) hebben wij deze perfecte omstandigheden niet dus ze gaan
trager groeien
 1 of 2 celtypes bllijven over
o Oversimplificatie van het cultuurmedium
 Zenuwstelsel en endocriene organen ontbreken
o Cellulair metabolisme is meer constant
o Energiemetabolisme: glycolyse
 Minder belangrijke rol van de citroenzuurcyclus




HOOFDSTUK II:CEL EN WEEFSELKWEEKCULTUREN DEFENITIES

ORGAANCULTUUR

Orgaanculturen worden rechtstreeks uit organisme geïsoleerd  orgaanculturen gemaakt van:

o Embryonale organen
o Weefselfragmenten

Wordt dan gekweekt op een vloeistof- gas interfase

 behoud van 3D weefselstructuur + functie van weefsel