Forensische genetica
1. Data-analyse
1.1 Analyse van CE data: fragment analyse
Componenten nodig voor fragment analyse en genotypering
Elk CE-staal bevat naast formamide en het PCR-product ook een “internal Lane standard” (ILS)
- Essentieel voor het bepalen van de lengte van de PCR-fragmenten.
• ILS: nauwkeurigheid bepalen van de fragmentlengte.
• Heeft een andere kleur dan het geïnteresseerde PCR-product
- Andere fluo-dye dan het te analyseren PCR-product.
- Formamide = oplosmiddel en denaturatiemiddel voor de DNA-fragmenten in het CE-staal. Zorgt
dat de DNA-strengen in een enkelstrengige vorm blijven (is essentieel voor een consistente
scheiding en analyse)
Elke reeks van analyses bevat ten minste één CE-staal met naast formamide en ILS ook een “Allelische
ladder”: synthetische standaard
- Allelische ladder: bevat een reeks synthetische DNA-standaarden met bekende
fragmentlengtes en wordt als referentie gebruikt om de genetische profielen in het monster te
interpreteren
• Bekende genetische variaties (allelen) bij een specifieke locus te identificeren en toe te
wijzen aan de fragmenten in het monster.
- Allelische ladder wordt simultaan met de andere stalen geanalyseerd (= standaard aanwezig in
elke gecommercialiseerde kit)
1.1.1 Bepaling lengte allelen: “Internal Lane Standard”
Speelt een cruciale rol bij het bepalen van de lengte van de allelen in fragmentanalyse door CE.
Hoe werkt de bepaling van allel-lengtes m.b.v. ILS?
Toevoegen van de ILS aan elk monster
- ILS bevat een mengsel van DNA-fragmenten met bekende lengtes (in basenparen). Elk fragment
in de ILS is voorzien van een fluorescente kleurstof die verschilt van de kleurstoffen die worden
gebruikt voor de PCR-producten van het monster zelf.
- Dit maakt het mogelijk om de ILS-fragmenten visueel te onderscheiden van de daadwerkelijke
DNA-fragmenten van het monster.
Capillaire Elektroforese (CE)
- In de CE worden de ILS en de PCR-producten van het monster samen door een capillair
gestuurd, waar ze worden gescheiden o.b.v. hun lengte (grootte).
- Detectie van fluorescente signalen: de pieken van de ILS-fragmenten zijn uniek vanwege hun
andere kleurstof en worden gemakkelijk herkend in de data.
, Kalibreren van de fragmentlengtes m.b.v. ILS
- Lengtes van de ILS-fragmenten zijn bekend → ILS =
interne referentie voor het gehele monster → lengte-
kalibratiecurve maken
• Curve corrigeert variaties in de
omstandigheden binnen de capillair
Bepalen van de allel-lengtes
- Zodra de lengte van elk PCR-fragment bepaald is,
kan het worden vergeleken met een allelische ladder
om het bijbehorende allel vast te stellen
• Allelische ladder bevat standaardfragmenten die overeenkomen met bekende
allellengtes, zodat een fragmentlengte in het monster gekoppeld kan worden aan een
specifieke genetische variant of allel.
Lengte van de fragmenten wordt bepaald a.d.h.v. een curve.
1.1.2 Allelische ladder: ontwikkeling
Artificieel mengsel van verschillende frequent voorkomende STR allelen
Zelfde primer-set als deze die gebruikt wordt in de multiplex kit voor de analyse van onbekende stalen.
Exact aantal herhalingsmotiven is gekend van elk fragment via sequentie analyse.
Populatie studio: essentieel om het aantal frequente allelen te kennen
Een allelische ladder is een mengsel van synthetische DNA-fragmenten die exact overeenkomen met de
bekende allelen voor een bepaalde genetische locus. Elk fragment in de allelische ladder heeft een vooraf
bepaalde lengte die overeenkomt met een specifiek allel.
Individuele PCR-reacties:
Elke PCR-reactie in de eerste stap van het schema
vertegenwoordigt een reactie die een specifiek allel
voor een bepaalde locus versterkt (amplificeert).
Elk van deze afzonderlijke PCR-reacties resulteert in
een DNA-fragment van een specifieke lengte,
overeenkomend met een specifiek allel voor die
locus.
Combineren van fragmenten in equimolaire hoeveelheden:
Verschillende fragmenten uit deze individuele PCR-reacties samengevoegd in één reactiemengsel
Equimolaire hoeveelheide = elk fragment in dezelfde concentratie aanwezig is.
Samengestelde mengsel bevat nu fragmenten van alle mogelijke allelen voor de locus en dient als
standaard voor identificatie.
, Gebruik van de allelische ladder in CE:
Gecombineerde mengsel wordt opnieuw onderworpen aan een PCR, of direct gebruikt in de CE.
De gecombineerde allelen vormen de allelische ladder, die tijdens de CE-analyse wordt gebruikt om de
fragmenten van onbekende monsters te vergelijken. Elk allel in de ladder heeft een unieke lengte en
dient als referentiepunt om de corresponderende fragmenten in de monsters te identificeren.
De combinatie van allelische ladders heeft betrekking op het
samenvoegen van allelische ladders voor meerder loci of markers in
één enkele reactiemix. Dit stelt onderzoekers in staat om meerdere
genetische markers gelijktijdig te analyseren in één run.
Bijv. uit een beperkte kit
Dicht bij elkaar en geen overlap tussen allelen
Spectrale kalibratie is een proces dat wordt uitgevoerd op
CE-instrumenten om ervoor te zorgen dat het
softwareprogramma dat de gegevens analyseert, kan
herkennen welke kleurstof (dye) is gekoppeld aan elk
gedetecteerd DNA-fragment.
Elk DNA-fragment wordt gelabeld met een specifieke
kleurstof, en door kalibratie kan het instrument de kleurstof
die aan elk fragment is gekoppeld correct identificeren.
Een spectrale kalibratie wordt uitgevoerd door een
standaardset DNA-fragmenten te testen, elk gemerkt met
een enkele kleurstof = matrixstandaarden.
Tijdens de kalibratie worden gegevens van elke afzonderlijke kleurstof geanalyseerd.
Een interne standaard: voor het bepalen van de lengten
Allelische ladder voor identificatie.
1.2 Electropherogram
Grafische weergave van gegevens die worden verkregen door CE.
Toont de detectie van DNA-fragmenten die zijn gescheiden o.b.v. hun lengte en worden gemeten aan de hand van
hun fluorescentiesignaal. Het elektroférogram helpt bij het visualiseren en analyseren van DNA-profielen door
het tonen van pieken die corresponderen met de aanwezigheid van specifieke DNA-fragmenten (allelen)
1. Data-analyse
1.1 Analyse van CE data: fragment analyse
Componenten nodig voor fragment analyse en genotypering
Elk CE-staal bevat naast formamide en het PCR-product ook een “internal Lane standard” (ILS)
- Essentieel voor het bepalen van de lengte van de PCR-fragmenten.
• ILS: nauwkeurigheid bepalen van de fragmentlengte.
• Heeft een andere kleur dan het geïnteresseerde PCR-product
- Andere fluo-dye dan het te analyseren PCR-product.
- Formamide = oplosmiddel en denaturatiemiddel voor de DNA-fragmenten in het CE-staal. Zorgt
dat de DNA-strengen in een enkelstrengige vorm blijven (is essentieel voor een consistente
scheiding en analyse)
Elke reeks van analyses bevat ten minste één CE-staal met naast formamide en ILS ook een “Allelische
ladder”: synthetische standaard
- Allelische ladder: bevat een reeks synthetische DNA-standaarden met bekende
fragmentlengtes en wordt als referentie gebruikt om de genetische profielen in het monster te
interpreteren
• Bekende genetische variaties (allelen) bij een specifieke locus te identificeren en toe te
wijzen aan de fragmenten in het monster.
- Allelische ladder wordt simultaan met de andere stalen geanalyseerd (= standaard aanwezig in
elke gecommercialiseerde kit)
1.1.1 Bepaling lengte allelen: “Internal Lane Standard”
Speelt een cruciale rol bij het bepalen van de lengte van de allelen in fragmentanalyse door CE.
Hoe werkt de bepaling van allel-lengtes m.b.v. ILS?
Toevoegen van de ILS aan elk monster
- ILS bevat een mengsel van DNA-fragmenten met bekende lengtes (in basenparen). Elk fragment
in de ILS is voorzien van een fluorescente kleurstof die verschilt van de kleurstoffen die worden
gebruikt voor de PCR-producten van het monster zelf.
- Dit maakt het mogelijk om de ILS-fragmenten visueel te onderscheiden van de daadwerkelijke
DNA-fragmenten van het monster.
Capillaire Elektroforese (CE)
- In de CE worden de ILS en de PCR-producten van het monster samen door een capillair
gestuurd, waar ze worden gescheiden o.b.v. hun lengte (grootte).
- Detectie van fluorescente signalen: de pieken van de ILS-fragmenten zijn uniek vanwege hun
andere kleurstof en worden gemakkelijk herkend in de data.
, Kalibreren van de fragmentlengtes m.b.v. ILS
- Lengtes van de ILS-fragmenten zijn bekend → ILS =
interne referentie voor het gehele monster → lengte-
kalibratiecurve maken
• Curve corrigeert variaties in de
omstandigheden binnen de capillair
Bepalen van de allel-lengtes
- Zodra de lengte van elk PCR-fragment bepaald is,
kan het worden vergeleken met een allelische ladder
om het bijbehorende allel vast te stellen
• Allelische ladder bevat standaardfragmenten die overeenkomen met bekende
allellengtes, zodat een fragmentlengte in het monster gekoppeld kan worden aan een
specifieke genetische variant of allel.
Lengte van de fragmenten wordt bepaald a.d.h.v. een curve.
1.1.2 Allelische ladder: ontwikkeling
Artificieel mengsel van verschillende frequent voorkomende STR allelen
Zelfde primer-set als deze die gebruikt wordt in de multiplex kit voor de analyse van onbekende stalen.
Exact aantal herhalingsmotiven is gekend van elk fragment via sequentie analyse.
Populatie studio: essentieel om het aantal frequente allelen te kennen
Een allelische ladder is een mengsel van synthetische DNA-fragmenten die exact overeenkomen met de
bekende allelen voor een bepaalde genetische locus. Elk fragment in de allelische ladder heeft een vooraf
bepaalde lengte die overeenkomt met een specifiek allel.
Individuele PCR-reacties:
Elke PCR-reactie in de eerste stap van het schema
vertegenwoordigt een reactie die een specifiek allel
voor een bepaalde locus versterkt (amplificeert).
Elk van deze afzonderlijke PCR-reacties resulteert in
een DNA-fragment van een specifieke lengte,
overeenkomend met een specifiek allel voor die
locus.
Combineren van fragmenten in equimolaire hoeveelheden:
Verschillende fragmenten uit deze individuele PCR-reacties samengevoegd in één reactiemengsel
Equimolaire hoeveelheide = elk fragment in dezelfde concentratie aanwezig is.
Samengestelde mengsel bevat nu fragmenten van alle mogelijke allelen voor de locus en dient als
standaard voor identificatie.
, Gebruik van de allelische ladder in CE:
Gecombineerde mengsel wordt opnieuw onderworpen aan een PCR, of direct gebruikt in de CE.
De gecombineerde allelen vormen de allelische ladder, die tijdens de CE-analyse wordt gebruikt om de
fragmenten van onbekende monsters te vergelijken. Elk allel in de ladder heeft een unieke lengte en
dient als referentiepunt om de corresponderende fragmenten in de monsters te identificeren.
De combinatie van allelische ladders heeft betrekking op het
samenvoegen van allelische ladders voor meerder loci of markers in
één enkele reactiemix. Dit stelt onderzoekers in staat om meerdere
genetische markers gelijktijdig te analyseren in één run.
Bijv. uit een beperkte kit
Dicht bij elkaar en geen overlap tussen allelen
Spectrale kalibratie is een proces dat wordt uitgevoerd op
CE-instrumenten om ervoor te zorgen dat het
softwareprogramma dat de gegevens analyseert, kan
herkennen welke kleurstof (dye) is gekoppeld aan elk
gedetecteerd DNA-fragment.
Elk DNA-fragment wordt gelabeld met een specifieke
kleurstof, en door kalibratie kan het instrument de kleurstof
die aan elk fragment is gekoppeld correct identificeren.
Een spectrale kalibratie wordt uitgevoerd door een
standaardset DNA-fragmenten te testen, elk gemerkt met
een enkele kleurstof = matrixstandaarden.
Tijdens de kalibratie worden gegevens van elke afzonderlijke kleurstof geanalyseerd.
Een interne standaard: voor het bepalen van de lengten
Allelische ladder voor identificatie.
1.2 Electropherogram
Grafische weergave van gegevens die worden verkregen door CE.
Toont de detectie van DNA-fragmenten die zijn gescheiden o.b.v. hun lengte en worden gemeten aan de hand van
hun fluorescentiesignaal. Het elektroférogram helpt bij het visualiseren en analyseren van DNA-profielen door
het tonen van pieken die corresponderen met de aanwezigheid van specifieke DNA-fragmenten (allelen)
