Samenvatting OZM thema 1
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
technieken: immunoglobuline/antilichamen binden
aan een specifiek eiwit (Y-vorm). De Ig productie vindt
plaats door een B-cel. Er ondervindt een reactie van
antilichamen en antigenen. Het binden van de
antilichamen gebeurt passief door hydrofobe
interacties. Monoklonale antilichamen (1 epitoop
herkennen) & polyklonale (herkennen meerdere
epitopen).
De blocking buffer stopt de ongebonden antilichamen, voorkomt vals positieve
resultaten en bevat 5% BSA, waardoor het achtergrondsignaal verminderd
wordt. Tween is en surfactant die zorgt voor het minimaliseren van hydrofobe
interacties (niet-ionische detergent). Positieve controle: experimenten werken,
dus negatieve waarden zijn betrouwbaar. Negatieve controle: checken niet
specifieke binding en vals positieve resultaten. TMB is licht afhankelijk, waarmee
je dankzij UV de intensiteit van de fluorescentie kan meten en dus de
hoeveelheid antigeen. De stop buffer van zwavelzuur zet de kleur om van blauw
naar geel. Maak gebruik van een log-log fit voor de grafiek (heeft de hoogste
R2).
Direct ELISA Indirect ELISA
Hoeveelheid hoge Antigeen door passieve
molecuulgewicht absorptie gebonden
antigenen aan plaat
Antigeen door passieve Primaire niet gelabelde
absorptie vast aan plaat antilichaam bindt
Antigeen herkend door antigeen
antilichaam met een Secundaire gelabelde
enzym gebonden antilichaam bindt
primaire antilichaam
Sandwich ELISA Competitive ELISA
Meet hoeveel antigeen tussen 2 lagen Het primaire antilichaam zit gebonden aan
antilichamen zit de plaat
Primaire antilichaam zit gebonden aan de Dan toevoegen ongelabeld antigeen
plaat (sample antigeen, te onderzoeken) &
Dan sample met antigeen toevoegen gelabeld antigeen strijden voor binden
(heeft minimaal 2 epitopen, bindt primaire antilichaam
antilichaam) - Hoge % sample
Secundaire antilichaam antigeen
toevoegen (bindt (ongelabeld) =
antigeen) sterke daling in
Bevat antilichamen signaal
paren voor specifiek - Lage % sample
antigeen antigeen =
o Direct: secundaire minimale daling
antigeen is gelabeld van signaal tov
o Indirect: tertiaire well met alleen
antigeen met label is gelabelde antigenen
nodig om te binden aan
ongelabeld secundaire antigeen
, Bèta-lactamase-activiteit
Je kunt uitleggen hoe een SDS-PAGE en een Western Blot werken;
Je kunt uitleg geven over de verschillende gebruikte stoffen voor de SDS-PAGE en
Western Blot-techniek, waarom je deze stoffen toevoegt en waarom op dat punt in
het proces;
Je kunt uitleggen hoe je een Western Blot opbouwt en aan welke kant de eiwitten
op het membraan komen te zitten;
Je kunt begrijpen welke bandjes je op zowel de SDS-PAGE-gel als op de Western
Blot ziet en wat deze bandjes kunnen betekenen;
Je kunt de resultaten van je eigen SDS-PAGE en Western Blot analyseren en
interpreteren.
Sommige antibiotica bevatten een bèta-lactamring, er zijn bacteriën die bèta-
lactamase produceren en zo het antibioticum kan stoppen. Eerst moeten de
bacteriestammen in LB-medium verwarmd worden bij 95 graden om eiwitten vrij
te maken en dan centrifugeren.
1) Dankzij trichloorazijn (TCA) kun je de monsters precipiteren (door
beperkt volume op gel plaatsen).
2) Voor zekerheid dat er voldoende eiwit is voor SDS-page, kun je met UV
licht 280 nm de concentratie eiwitten bepalen, deze absorberen het UV
licht.
- Dankzij bepaalde restgroepen; tyrosine, tryptofaan en cysteïne
(aromatische aminozuren en zwavelbrugvormende, hoe hoger
absorptie, hoe hoger de eiwit%)
3) Vortexen, afdraaien eiwitten vormen pellet pipeteren pellet
4) Aceton toevoegen voor verwijderen TCA (TCA te zuur voor komende
buffer)
5) Verwijder supernatant (aceton/TCA) & drogen pellet
6) Toevoegen Laemmli sample buffer (LSB) samples geel
- 0.5M tris/HCl (pH= 6,8) (Base, buffer (pH 7,2 – 9,0))
- 10% SDS (verbreken H-bruggen, hydrofobe interacties en ionbindingen.
Polaire kop met negatieve ladingen, binden, uniform negatieve
eiwitten)
- 10% glycerol (verhoogt sample dichtheid, zakt naar bodem van wel)
- 14M 2-mercaptoethanol (verbreekt disulfide bindingen)
- 0,4% broomfenolblauw (kleurstof, zakt naar beneden, identificatie als
running klaar is)
7) Toevoegen Tris Base pH verhogen (kleuring mengsel slaat om naar
blauw) vortex
SDS-page:
De stacking gel heeft een lagere (bis)acrylamide concentratie, dus grotere
poriën (eiwitten even snel migreren) & een lagere pH (glycine neutraal,
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
technieken: immunoglobuline/antilichamen binden
aan een specifiek eiwit (Y-vorm). De Ig productie vindt
plaats door een B-cel. Er ondervindt een reactie van
antilichamen en antigenen. Het binden van de
antilichamen gebeurt passief door hydrofobe
interacties. Monoklonale antilichamen (1 epitoop
herkennen) & polyklonale (herkennen meerdere
epitopen).
De blocking buffer stopt de ongebonden antilichamen, voorkomt vals positieve
resultaten en bevat 5% BSA, waardoor het achtergrondsignaal verminderd
wordt. Tween is en surfactant die zorgt voor het minimaliseren van hydrofobe
interacties (niet-ionische detergent). Positieve controle: experimenten werken,
dus negatieve waarden zijn betrouwbaar. Negatieve controle: checken niet
specifieke binding en vals positieve resultaten. TMB is licht afhankelijk, waarmee
je dankzij UV de intensiteit van de fluorescentie kan meten en dus de
hoeveelheid antigeen. De stop buffer van zwavelzuur zet de kleur om van blauw
naar geel. Maak gebruik van een log-log fit voor de grafiek (heeft de hoogste
R2).
Direct ELISA Indirect ELISA
Hoeveelheid hoge Antigeen door passieve
molecuulgewicht absorptie gebonden
antigenen aan plaat
Antigeen door passieve Primaire niet gelabelde
absorptie vast aan plaat antilichaam bindt
Antigeen herkend door antigeen
antilichaam met een Secundaire gelabelde
enzym gebonden antilichaam bindt
primaire antilichaam
Sandwich ELISA Competitive ELISA
Meet hoeveel antigeen tussen 2 lagen Het primaire antilichaam zit gebonden aan
antilichamen zit de plaat
Primaire antilichaam zit gebonden aan de Dan toevoegen ongelabeld antigeen
plaat (sample antigeen, te onderzoeken) &
Dan sample met antigeen toevoegen gelabeld antigeen strijden voor binden
(heeft minimaal 2 epitopen, bindt primaire antilichaam
antilichaam) - Hoge % sample
Secundaire antilichaam antigeen
toevoegen (bindt (ongelabeld) =
antigeen) sterke daling in
Bevat antilichamen signaal
paren voor specifiek - Lage % sample
antigeen antigeen =
o Direct: secundaire minimale daling
antigeen is gelabeld van signaal tov
o Indirect: tertiaire well met alleen
antigeen met label is gelabelde antigenen
nodig om te binden aan
ongelabeld secundaire antigeen
, Bèta-lactamase-activiteit
Je kunt uitleggen hoe een SDS-PAGE en een Western Blot werken;
Je kunt uitleg geven over de verschillende gebruikte stoffen voor de SDS-PAGE en
Western Blot-techniek, waarom je deze stoffen toevoegt en waarom op dat punt in
het proces;
Je kunt uitleggen hoe je een Western Blot opbouwt en aan welke kant de eiwitten
op het membraan komen te zitten;
Je kunt begrijpen welke bandjes je op zowel de SDS-PAGE-gel als op de Western
Blot ziet en wat deze bandjes kunnen betekenen;
Je kunt de resultaten van je eigen SDS-PAGE en Western Blot analyseren en
interpreteren.
Sommige antibiotica bevatten een bèta-lactamring, er zijn bacteriën die bèta-
lactamase produceren en zo het antibioticum kan stoppen. Eerst moeten de
bacteriestammen in LB-medium verwarmd worden bij 95 graden om eiwitten vrij
te maken en dan centrifugeren.
1) Dankzij trichloorazijn (TCA) kun je de monsters precipiteren (door
beperkt volume op gel plaatsen).
2) Voor zekerheid dat er voldoende eiwit is voor SDS-page, kun je met UV
licht 280 nm de concentratie eiwitten bepalen, deze absorberen het UV
licht.
- Dankzij bepaalde restgroepen; tyrosine, tryptofaan en cysteïne
(aromatische aminozuren en zwavelbrugvormende, hoe hoger
absorptie, hoe hoger de eiwit%)
3) Vortexen, afdraaien eiwitten vormen pellet pipeteren pellet
4) Aceton toevoegen voor verwijderen TCA (TCA te zuur voor komende
buffer)
5) Verwijder supernatant (aceton/TCA) & drogen pellet
6) Toevoegen Laemmli sample buffer (LSB) samples geel
- 0.5M tris/HCl (pH= 6,8) (Base, buffer (pH 7,2 – 9,0))
- 10% SDS (verbreken H-bruggen, hydrofobe interacties en ionbindingen.
Polaire kop met negatieve ladingen, binden, uniform negatieve
eiwitten)
- 10% glycerol (verhoogt sample dichtheid, zakt naar bodem van wel)
- 14M 2-mercaptoethanol (verbreekt disulfide bindingen)
- 0,4% broomfenolblauw (kleurstof, zakt naar beneden, identificatie als
running klaar is)
7) Toevoegen Tris Base pH verhogen (kleuring mengsel slaat om naar
blauw) vortex
SDS-page:
De stacking gel heeft een lagere (bis)acrylamide concentratie, dus grotere
poriën (eiwitten even snel migreren) & een lagere pH (glycine neutraal,
