Overzicht Moleculaire Biotechnologie
Blok 2, Semester 1, Jaar 2, Toegepaste Biologie
Milou Nabuurs
Let op! Dit is enkel een overzicht van mijn hoorcollege aantekeningen + aanvullingen, ik kan niet garanderen dat het volledig compleet is, enkel dat ik denk dat dit alles is. Feedback is fijn :)
Leerdoelen
De student kan…
Uitleggen welke verschillende stappen nodig zijn bij moleculaire technieken vanaf het verzamelen van
de samples tot en met de resultaten van de moleculaire merker techniek.
Van twee sequentietechnieken uitleggen tot en met de resultaten hoe de sequentie van een onbekende
nucleotide volgorde van een stuk DNA bepaald kan worden.
Aan de hand van een gegeven werkwijze met een PCR en/of PCR-RFLP voorspellen welke resultaten
te verwachten zijn bij een gel-elektroforese.
De studente kan uitleggen hoe je variatie in het DNA of RNA zichtbaar kan maken met behulp van
de technieken; PCR-FLRP, microsatellieten, qPCR en ddPCR.
De student kan uitleggen hoe je variatie in de genexpressie met de RNA-techniek en Microarray en
RNA-sequencing zichtbaar kan maken.
De mechanismen waarop de RNA-transcriptie, RNA-processing en RNA-translatie wordt gereguleerd
schematisch uitwerken aan de hand van een voorbeeld.
Uitleggen hoe concentratieverschillen van regulerende stoffen leiden tot verschillen in genexpressie en
daarmee celdifferentiatie en -determinatie.
Uitleggen op welke manieren horizontale genoverdracht en genetische modificatie plaats vindt in de
natuur bij prokaryoten.
Uitleggen op welke manieren de mens genetische modificatie kan toepassen door gebruik te maken
van bij de in organismen voorkomende moleculaire mechanismen van horizontale genoverdracht en
CRISPR-Cas9.
Een onderdeel van een experiment of hypothese over de regulatie of modificatie van genexpressie
verder uitbouwen naar een met positieve en/of negatieve controle en een experimentele behandeling.
Inhoudsopgave
Leerdoelen ...................................................................................................................................................................... 1
HC 1 - Basis DNA technieken .................................................................................................................................... 2
HC 2 - DNA merkers ................................................................................................................................................... 5
HC 3 - Regulatie van de genexpressie ......................................................................................................................10
HC 4 – Regulatie van de genexpressie en horizontale gentransfer .....................................................................16
HC 5 - Genetische modificatie ..................................................................................................................................19
,HC 1 - Basis DNA technieken
Genetische merkers en DNA technieken. Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek die gebruikt
wordt voor DNA replicatie. Gel-elektroforese creërt vervolgens het pandenspoor patroon om het DNA
wat gerepliceerd is, zichtbaar te maken.
Genetische merkers
Zichtbaar maken van de variatie in het DNA en de gen-expressie. Dit kan op 3 verschillende niveau’s:
DNA, voor de genetische variatie.
(m)RNA, voor de verschillen in gen-expressie.
Eiwitten, voor de genexpressie en/of de genetische variatie.
Verschillende stappen;
DNA extractie, het zuiveren van het DNA er zitten dan nog eiwitten aan gekoppeld.
DNA restrictie, het knippen van een specifieke DNA sequentie.
DNA ligatie, het aan elkaar plakken van twee geknipte DNA-ketens.
DNA hybridisatie, complementair enkelstrengs DNA (ssDNA) stengen samenvoegen tot dubbelstrengs
DNA (sdDNA) tot een dubbele helix, met behulp van waterstofbruggen.
DNA replicatie of amplificatie, het vermenigvuldigen van DNA
DNA visualisatie, het zichtbaar maken van het DNA, bijvoorbeeld met behulp van gelelektroferese.
DNA extractie
Om aan een DNA-molecuul te komen vindt er eerst DNA extractie plaats waarbij het DNA wordt
geïsoleerd, hierbij worden o.a. de celwand, het celmembraan, histonen, eiwitten, DNA’ases e.d. verwijderd
om het DNA te isoleren. De DNA bronnen in een eukaryote cel zijn; het mitochondrium, de nucleus en bij
planten de chloroplasten.
Lyseren (oplossen) van cellen door het fijnmalen van weefsel bij planten of het toevoegen van zeept
woorden cel- en kernmembraan oplossen. Eiwitten worden afgebroken door een protease enzym toe te
voegen. Door de toevoeging van ijskoude alcohol ligt het DNA na centrifuge onderin de buis.
DNA restrictie
Vindt plaatst m.b.v. restrictie enzymen. Dit doen bacteriën natuurlijk bij
zichzelf. De enzymen knippen in DNA sequenties, bij de suiker-
fosfaatrug aan de buitenzijde. Ieder enzym heeft een specifieke plek waar
die knipt. De natuurlijke functies in de cel vernietigen virus DNA of
bouwen het juist op, ze zijn commercieel verkrijgbaar en er bestaan
honderden varianten. Ze kunnen specifiek/gericht zijn of willekeurig.
Als ze ‘sticky ends’ hebben kunnen ze gewoon met waterstofbruggen
tussen de nucleotide ‘plakken’. Als ze ‘blunt ends’ hebben knippen ze het
recht doormidden.
DNA ligatie
Het aan elkaar plakken van DNA fragmenten, m.b.v. een ligase enzym.
Nodig bij DNA replicatie, het uitwisselen van genetische informatie
tussen twee bacteriën, na conjugatie en bij het inbouwen van ssDNA na
de transformatie voordat de hybridisatie plaatsvindt.
Bij twee stukken met sticky ends kan er een ander stuk DNA in geligeerd
worden met ‘3 en ‘5 eindes. Bij blunt uiteindes is het ook mogelijk, maar
kost het veel meer moeite.
2
, DNA hybridisatie
Is de vorming van complementaire basenparen. Door twee enkelstrengs moleculen met elkaar te verbinden
met waterstofbruggen. Bij de DNA-replicatie verzorgt het enzym DNA-polymerase de hybridisatie.
Hybridisatie is het combineren van elektron orbitalen van een atoom.
DNA replicatie
Bij normale replicatie in het lichaam heb je topoisomerase en helicase nodig om de DNA uit elkaar te
wikkelen en te houden. Bij de PCR wordt het DNA mengseltje verwarmt tot 95 graden waardoor er geen
topoisomerase en helicase nodig zijn. Bij DNA synthese ga je net iets anders te werk als bij normale
replicatie. Je kunt gebruik maken van oligonucleotides (korte nucleotideteketens): Primers (enkelstrengs
rond de 18-25 nucleotiden). Adapters (lijken op primers maar zijn dubbel strengs)(komt terug bij next
generation seqencing). Probes (enkelstrengs rond de 100-1000 nucleotiden)(komt terug bij micro array).
DNA synthese
Oligonucleotides. Primers (enkelstrengs) zijn nodig om DNA-polymerase te laten starten met de aanmaak
van de complementaire DNA-streng. Adapters (dubbelstrengs) zijn korte stukjes DNA die zich hechten aan
het target DNA om het bijvoorbeeld aan het oppervlak te binden. Probes (enkelstrens), zijn gelabelde stukjes
DNA of RNA waarvan de structuur volledig complementair is aan het op te sporen stuk DNA of RNA.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Geschikt voor DNA van 100-1500 nucleotiden, niet geschikt
voor bijvoorbeeld hele chromosomen. Het doel is om de target
sequence te verdubbelen. Hier komen verschillende stappen bij
kijken;
1) Denaturation; dubbelstrengs DNA wordt uit elkaar
gehaald, de waterstofbruggen worden met behulp van hitte
verbroken waardoor er twee enkelstrengs DNA strengen
overblijven.
2) Annealing; de primers worden geplaatst.
3) Extension; het verlengen, nieuwe nucleotiden worden
toegevoegd zodat het weer dubbelstrengs wordt.
Na 3 rondes heb je 8 kopieën van de target sequence. Er zijn er
dan 2 die de juiste doel sequentie hebben. De cyclus wordt nog
veel vaker herhaald en gekleurd. Na nog 30 rondes heb je een
miljard moleculen van de target sequence.
3
Blok 2, Semester 1, Jaar 2, Toegepaste Biologie
Milou Nabuurs
Let op! Dit is enkel een overzicht van mijn hoorcollege aantekeningen + aanvullingen, ik kan niet garanderen dat het volledig compleet is, enkel dat ik denk dat dit alles is. Feedback is fijn :)
Leerdoelen
De student kan…
Uitleggen welke verschillende stappen nodig zijn bij moleculaire technieken vanaf het verzamelen van
de samples tot en met de resultaten van de moleculaire merker techniek.
Van twee sequentietechnieken uitleggen tot en met de resultaten hoe de sequentie van een onbekende
nucleotide volgorde van een stuk DNA bepaald kan worden.
Aan de hand van een gegeven werkwijze met een PCR en/of PCR-RFLP voorspellen welke resultaten
te verwachten zijn bij een gel-elektroforese.
De studente kan uitleggen hoe je variatie in het DNA of RNA zichtbaar kan maken met behulp van
de technieken; PCR-FLRP, microsatellieten, qPCR en ddPCR.
De student kan uitleggen hoe je variatie in de genexpressie met de RNA-techniek en Microarray en
RNA-sequencing zichtbaar kan maken.
De mechanismen waarop de RNA-transcriptie, RNA-processing en RNA-translatie wordt gereguleerd
schematisch uitwerken aan de hand van een voorbeeld.
Uitleggen hoe concentratieverschillen van regulerende stoffen leiden tot verschillen in genexpressie en
daarmee celdifferentiatie en -determinatie.
Uitleggen op welke manieren horizontale genoverdracht en genetische modificatie plaats vindt in de
natuur bij prokaryoten.
Uitleggen op welke manieren de mens genetische modificatie kan toepassen door gebruik te maken
van bij de in organismen voorkomende moleculaire mechanismen van horizontale genoverdracht en
CRISPR-Cas9.
Een onderdeel van een experiment of hypothese over de regulatie of modificatie van genexpressie
verder uitbouwen naar een met positieve en/of negatieve controle en een experimentele behandeling.
Inhoudsopgave
Leerdoelen ...................................................................................................................................................................... 1
HC 1 - Basis DNA technieken .................................................................................................................................... 2
HC 2 - DNA merkers ................................................................................................................................................... 5
HC 3 - Regulatie van de genexpressie ......................................................................................................................10
HC 4 – Regulatie van de genexpressie en horizontale gentransfer .....................................................................16
HC 5 - Genetische modificatie ..................................................................................................................................19
,HC 1 - Basis DNA technieken
Genetische merkers en DNA technieken. Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek die gebruikt
wordt voor DNA replicatie. Gel-elektroforese creërt vervolgens het pandenspoor patroon om het DNA
wat gerepliceerd is, zichtbaar te maken.
Genetische merkers
Zichtbaar maken van de variatie in het DNA en de gen-expressie. Dit kan op 3 verschillende niveau’s:
DNA, voor de genetische variatie.
(m)RNA, voor de verschillen in gen-expressie.
Eiwitten, voor de genexpressie en/of de genetische variatie.
Verschillende stappen;
DNA extractie, het zuiveren van het DNA er zitten dan nog eiwitten aan gekoppeld.
DNA restrictie, het knippen van een specifieke DNA sequentie.
DNA ligatie, het aan elkaar plakken van twee geknipte DNA-ketens.
DNA hybridisatie, complementair enkelstrengs DNA (ssDNA) stengen samenvoegen tot dubbelstrengs
DNA (sdDNA) tot een dubbele helix, met behulp van waterstofbruggen.
DNA replicatie of amplificatie, het vermenigvuldigen van DNA
DNA visualisatie, het zichtbaar maken van het DNA, bijvoorbeeld met behulp van gelelektroferese.
DNA extractie
Om aan een DNA-molecuul te komen vindt er eerst DNA extractie plaats waarbij het DNA wordt
geïsoleerd, hierbij worden o.a. de celwand, het celmembraan, histonen, eiwitten, DNA’ases e.d. verwijderd
om het DNA te isoleren. De DNA bronnen in een eukaryote cel zijn; het mitochondrium, de nucleus en bij
planten de chloroplasten.
Lyseren (oplossen) van cellen door het fijnmalen van weefsel bij planten of het toevoegen van zeept
woorden cel- en kernmembraan oplossen. Eiwitten worden afgebroken door een protease enzym toe te
voegen. Door de toevoeging van ijskoude alcohol ligt het DNA na centrifuge onderin de buis.
DNA restrictie
Vindt plaatst m.b.v. restrictie enzymen. Dit doen bacteriën natuurlijk bij
zichzelf. De enzymen knippen in DNA sequenties, bij de suiker-
fosfaatrug aan de buitenzijde. Ieder enzym heeft een specifieke plek waar
die knipt. De natuurlijke functies in de cel vernietigen virus DNA of
bouwen het juist op, ze zijn commercieel verkrijgbaar en er bestaan
honderden varianten. Ze kunnen specifiek/gericht zijn of willekeurig.
Als ze ‘sticky ends’ hebben kunnen ze gewoon met waterstofbruggen
tussen de nucleotide ‘plakken’. Als ze ‘blunt ends’ hebben knippen ze het
recht doormidden.
DNA ligatie
Het aan elkaar plakken van DNA fragmenten, m.b.v. een ligase enzym.
Nodig bij DNA replicatie, het uitwisselen van genetische informatie
tussen twee bacteriën, na conjugatie en bij het inbouwen van ssDNA na
de transformatie voordat de hybridisatie plaatsvindt.
Bij twee stukken met sticky ends kan er een ander stuk DNA in geligeerd
worden met ‘3 en ‘5 eindes. Bij blunt uiteindes is het ook mogelijk, maar
kost het veel meer moeite.
2
, DNA hybridisatie
Is de vorming van complementaire basenparen. Door twee enkelstrengs moleculen met elkaar te verbinden
met waterstofbruggen. Bij de DNA-replicatie verzorgt het enzym DNA-polymerase de hybridisatie.
Hybridisatie is het combineren van elektron orbitalen van een atoom.
DNA replicatie
Bij normale replicatie in het lichaam heb je topoisomerase en helicase nodig om de DNA uit elkaar te
wikkelen en te houden. Bij de PCR wordt het DNA mengseltje verwarmt tot 95 graden waardoor er geen
topoisomerase en helicase nodig zijn. Bij DNA synthese ga je net iets anders te werk als bij normale
replicatie. Je kunt gebruik maken van oligonucleotides (korte nucleotideteketens): Primers (enkelstrengs
rond de 18-25 nucleotiden). Adapters (lijken op primers maar zijn dubbel strengs)(komt terug bij next
generation seqencing). Probes (enkelstrengs rond de 100-1000 nucleotiden)(komt terug bij micro array).
DNA synthese
Oligonucleotides. Primers (enkelstrengs) zijn nodig om DNA-polymerase te laten starten met de aanmaak
van de complementaire DNA-streng. Adapters (dubbelstrengs) zijn korte stukjes DNA die zich hechten aan
het target DNA om het bijvoorbeeld aan het oppervlak te binden. Probes (enkelstrens), zijn gelabelde stukjes
DNA of RNA waarvan de structuur volledig complementair is aan het op te sporen stuk DNA of RNA.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Geschikt voor DNA van 100-1500 nucleotiden, niet geschikt
voor bijvoorbeeld hele chromosomen. Het doel is om de target
sequence te verdubbelen. Hier komen verschillende stappen bij
kijken;
1) Denaturation; dubbelstrengs DNA wordt uit elkaar
gehaald, de waterstofbruggen worden met behulp van hitte
verbroken waardoor er twee enkelstrengs DNA strengen
overblijven.
2) Annealing; de primers worden geplaatst.
3) Extension; het verlengen, nieuwe nucleotiden worden
toegevoegd zodat het weer dubbelstrengs wordt.
Na 3 rondes heb je 8 kopieën van de target sequence. Er zijn er
dan 2 die de juiste doel sequentie hebben. De cyclus wordt nog
veel vaker herhaald en gekleurd. Na nog 30 rondes heb je een
miljard moleculen van de target sequence.
3
