Hoofdstuk 12: diagnostiek
1. Inleiding
Onderzoek aangevraagd door arts: infectie? Verwekker? Bruikbare antimicrobiële gnl?
Welke monsters afnemen en hoe? > aanvraagformulier
Technieken:
- Microscopie
- Kweek + identificatie (tijdsverlies)
- Antigendetectie
- Moleculaire detectietechnieken
- Serologie: antilichamen?
- Antibiogram: voor pt en gemeenschap
- Niet routinematig: fingerprinting, viruskweek
Typische klinische beelden: mazelen, TBC
-> zelden is het ziektebeeld zo suggestief dat de diagnose en verwekker meteen
duidelijk zijn: minder typische beelden of meerdere verwekkers van ziekte
Diagnostiek:
- Microscoop
- Kweek: eenvoudige bodems – bact
- Celkweek: virussen, chlamydiae
- Niet-kweek: antigen, genoom
- Immuunantwoord: serologie/huidtest
2. Directe detectie
*microscopie
LM: 1000x > 0.2micron
- Zonder fixatie en kleuring: fungi, parasieten, UWI, wet stain > vaginaal uitstrijkje
- Met fixatie en kleuring: bact – gramkleuring, mycobact – zuurvaste kleuring
Virussen, mycoplasmata, chlamydiae indirect zichtbaar
door cytopathogeen effect op celcultuur
FM: MO gekleurd met antiserum/probe met fluorescerende marker (FISH)
- Antigenen van bact, vooral virussen
EM: voor virussen (geen routine)
Vb gramkleuring van lumbaalvocht bij meningitis
- Gram+ diplococcen > pneumokok als verwekker R/ ceftriaxone
Geen secundaire gevallen
- Gram- diplococcen > meningokok als verwekker R/ nauw spectrum
preventie van secundaire gevallen penicilline/amoxicilline
(vaak niet zo eenduidig)
Vb gramkleuring feces: mengsel van bact; onmogelijk om pathogenen erin te herkennen
,Zuurvaste kleuring vb ziehl-neelsen kleuring en auramine kleuring
Auramine = fluorescerende mol afgelezen op FM
*Niet-microscopische methoden: opsporen van pathogeen zonder in vitro amplificatie
(LM niet mogelijk w kiem te klein, verborgen of geen typisch voorkomen)
- Voor virussen, bact, schimmels, protozoa
- Meestal antilichaam gebaseerd vb nucleinezuurhybridisatie
1 bact
- pneumokok/legionella anitgen test op urine bij verdenking pneumonie
- C. difficile toxine detectie in feces bij typische diarree
Pos staal: coltrole+, test+ neg staal: controle+, test-
2 virussen
- Stoelgang: antigen testen voor rota virus (diarree kind)
- Resp: resp syncytiaal virus RSV (bronchiolitis kind), influenza
- Bloed: vensterperiode acute infectie verkleinen (periode tss infectie en
serologische activiteit vb HBV, HIV)
- Vaginaal: HPV in situ hybridisatie
3 schimmels
- Serum: galactomannan polysaccharide op celwand aspergillus spp.
4 protozoa
- Bloed: sneltest plasmodium spp., antigendetectie voor malaria
Sandwich ELISA: antigen x capture antilichaam
-> 2e antilichaam met enzyme bindt antigen
-> detectie antigen obv enzymatische reactie
Controlestaal: toont dat test werkt, dat Ab Ag binden
Microscopisch Niet-microscopisch
- Snel: (15’) - Snel: min-zelfde dag, eenvoudig
- Goedkoop - Duur, veel afval
- Aspecifiek door bijmenging no flora + - Specifiek: gericht zoeken, je mist
aspecifieke morfotypes eventuele andere oorzaken
- Toont inflam (veel PMN) en staalkwaliteit - Gevoeligheid is beperkt bij sommige
(slecht bij plaveiselcellen in sputumstaal) testen
- Wet stain voor 3 verwekkers vaginitis:
candida, thrichomonas, bact vaginose
3. Detectie na amplificatie
Optimale voedingsbodem: suiker, N, buffer, mineralen,…
Optimale T: 36°
Optimale atmosferische condities: (an)aeroob, capnofiel,..
,*Vloeibare kweekbodems: troebel of niet, + of -, bact
*Agarbodems: 1 bact -> 1 kolonie, meerdere bact -> meerdere kolonies
Uitzicht geeft een idee van hoeveelheid en soort groep, genus of species
-> zelfden is identificatie daarmee volledig
Staal uitsmeren in een dillutie over 3 segmenten: isolatie van afzonderlijke kolonies
> Semikwantitatief rapporteren:
+ enkel kolonies hier, maar elders niet want eig te weinig bact
++ kolonie ontstaat altijd, veel bact in
+++ stampvol vd verwekker
> kwantitatief rapporteren: KVE kolonievormende eenheden / CFU per V
Specifieke/selectieve bodems gebruikt om bep kolonies te kweken in mengflora
Bloed toevoegen, selectiever maken, differentieel maken (pH), ab inbouwen
*MaldiTOF massaspectrografie
Matrix-assisted laser desorption/ionization Time of flight (24u)
-> zonder voorkennis de bactgroep identificeren
Identificatiestrategiën verschillend per bact
Kleine hoeveelheid bact op dragen gefixeerd in toestel: met laser gefragmenteerd, eiw in
deeltjes en naar andere kant vd buis gestuurd
-> grote fragmenten gaan traag, kleine fragmenten gaan snel (time of flight)
Registratie via piekenpatroon
Moeilijk kweekbare MO:
- Anaeroben: kweek en transport zonder O2!
- Trage groeiers: mycobact (na weken)
- Niet op klassieke bodems: mycoplasmata (speciale media), chlamydia in cellijnen
- Onkweekbaar of enkel in dier: mycobact leprae, treponema pallidum (syfilis)
- Schimmels en gisten: soms selectieve bodems, soms trage groei
- Virussen: op cellijnen, zichtbaar door cytopathogeen effect of bij
immuundetectie/hybridisatie, soms onkweekbaar -> gespecialiseerde labs
- Protozoa: niet kweekbaar in routine diagnostiek
Interpretatie bact onderzoek: obv klinische vraag, niet alles identificeren!
- Urine: vol commensale bact (400-500)
- Bloed: geen bact dus alles geraporteerd
Vb
keeluitstrijk: strept pyogenes hemolytische kolonies op bloedagar? Nee = ‘banale flora’
Sputum: pneumokok, H influenzae, S. aureus,..
Feces: Salmonella, Campylobacter,… verdachte kolonies op selectieve bodem?
-> nee = stoppen, ja = identificatie pathogenen
, Staaltypes:
wit = potentiele verwekker
zwart = no flora
Type 1: staal afgenomen op plaats zonder no flora
huid desinfecteren, anders contaminatie met huidbewoners
kiem gevonden = pathogeen
vb lumbaalpunctie, hemocultuur/bloedkweek
Type 2: staal afgenomen op plaats zonder no flora, maar passeert een zone met no flora
Vb blaas, bronchi
Maatregelen in labo (bij afnama, transport, verwerking) om pathogenen te zoeken
Type 3: monster met pathogenen tss de bestaande commensale flora
Vb stoelgang, keel, wonde, vagina
Gekende verwekker zoeken op selectieve bodems
Lange analysetijd voor microbiologische onderzoeken (afh van transport, wacht en
rapporteringstijd)
- Microscopie: min – dag
- Kweek + identificatie: 24-48u klassieke testen + 1d, MALDI-TOF zelfde dag
- Autobiogram: 48u
+ evt extra tijd: transport, sluitingstijd labo, langdurige groei pathogenen,…
Virussen, mycobact, mycoplasmata, anaeroben -> trager, complexer
Dus vaak blind starten met therapie, erna bijsturen
- Gebaseerd op PCR (sneller dan groei) -> evolutie naar automatisatie (sequencing)
- Kwantitatief
- Staalvoorbereiding, contaminatie tegengaan
- Voor alle pathogenen
- Zeer specifiek en gevoelig (voor en nadeel)
Bact: direct op staal of combinatie met kweek -> aanw aantonen, R detecteren,
stammen vergelijken, diversiteit flora onderzoeken
Virussen: direct op staal -> aanw aantonen + kwantificeren, virale varianten typeren, R
bepalen op genniveau
Schimmels, protozoa, wormen: direct op staal -> aanw aantonen
1. Inleiding
Onderzoek aangevraagd door arts: infectie? Verwekker? Bruikbare antimicrobiële gnl?
Welke monsters afnemen en hoe? > aanvraagformulier
Technieken:
- Microscopie
- Kweek + identificatie (tijdsverlies)
- Antigendetectie
- Moleculaire detectietechnieken
- Serologie: antilichamen?
- Antibiogram: voor pt en gemeenschap
- Niet routinematig: fingerprinting, viruskweek
Typische klinische beelden: mazelen, TBC
-> zelden is het ziektebeeld zo suggestief dat de diagnose en verwekker meteen
duidelijk zijn: minder typische beelden of meerdere verwekkers van ziekte
Diagnostiek:
- Microscoop
- Kweek: eenvoudige bodems – bact
- Celkweek: virussen, chlamydiae
- Niet-kweek: antigen, genoom
- Immuunantwoord: serologie/huidtest
2. Directe detectie
*microscopie
LM: 1000x > 0.2micron
- Zonder fixatie en kleuring: fungi, parasieten, UWI, wet stain > vaginaal uitstrijkje
- Met fixatie en kleuring: bact – gramkleuring, mycobact – zuurvaste kleuring
Virussen, mycoplasmata, chlamydiae indirect zichtbaar
door cytopathogeen effect op celcultuur
FM: MO gekleurd met antiserum/probe met fluorescerende marker (FISH)
- Antigenen van bact, vooral virussen
EM: voor virussen (geen routine)
Vb gramkleuring van lumbaalvocht bij meningitis
- Gram+ diplococcen > pneumokok als verwekker R/ ceftriaxone
Geen secundaire gevallen
- Gram- diplococcen > meningokok als verwekker R/ nauw spectrum
preventie van secundaire gevallen penicilline/amoxicilline
(vaak niet zo eenduidig)
Vb gramkleuring feces: mengsel van bact; onmogelijk om pathogenen erin te herkennen
,Zuurvaste kleuring vb ziehl-neelsen kleuring en auramine kleuring
Auramine = fluorescerende mol afgelezen op FM
*Niet-microscopische methoden: opsporen van pathogeen zonder in vitro amplificatie
(LM niet mogelijk w kiem te klein, verborgen of geen typisch voorkomen)
- Voor virussen, bact, schimmels, protozoa
- Meestal antilichaam gebaseerd vb nucleinezuurhybridisatie
1 bact
- pneumokok/legionella anitgen test op urine bij verdenking pneumonie
- C. difficile toxine detectie in feces bij typische diarree
Pos staal: coltrole+, test+ neg staal: controle+, test-
2 virussen
- Stoelgang: antigen testen voor rota virus (diarree kind)
- Resp: resp syncytiaal virus RSV (bronchiolitis kind), influenza
- Bloed: vensterperiode acute infectie verkleinen (periode tss infectie en
serologische activiteit vb HBV, HIV)
- Vaginaal: HPV in situ hybridisatie
3 schimmels
- Serum: galactomannan polysaccharide op celwand aspergillus spp.
4 protozoa
- Bloed: sneltest plasmodium spp., antigendetectie voor malaria
Sandwich ELISA: antigen x capture antilichaam
-> 2e antilichaam met enzyme bindt antigen
-> detectie antigen obv enzymatische reactie
Controlestaal: toont dat test werkt, dat Ab Ag binden
Microscopisch Niet-microscopisch
- Snel: (15’) - Snel: min-zelfde dag, eenvoudig
- Goedkoop - Duur, veel afval
- Aspecifiek door bijmenging no flora + - Specifiek: gericht zoeken, je mist
aspecifieke morfotypes eventuele andere oorzaken
- Toont inflam (veel PMN) en staalkwaliteit - Gevoeligheid is beperkt bij sommige
(slecht bij plaveiselcellen in sputumstaal) testen
- Wet stain voor 3 verwekkers vaginitis:
candida, thrichomonas, bact vaginose
3. Detectie na amplificatie
Optimale voedingsbodem: suiker, N, buffer, mineralen,…
Optimale T: 36°
Optimale atmosferische condities: (an)aeroob, capnofiel,..
,*Vloeibare kweekbodems: troebel of niet, + of -, bact
*Agarbodems: 1 bact -> 1 kolonie, meerdere bact -> meerdere kolonies
Uitzicht geeft een idee van hoeveelheid en soort groep, genus of species
-> zelfden is identificatie daarmee volledig
Staal uitsmeren in een dillutie over 3 segmenten: isolatie van afzonderlijke kolonies
> Semikwantitatief rapporteren:
+ enkel kolonies hier, maar elders niet want eig te weinig bact
++ kolonie ontstaat altijd, veel bact in
+++ stampvol vd verwekker
> kwantitatief rapporteren: KVE kolonievormende eenheden / CFU per V
Specifieke/selectieve bodems gebruikt om bep kolonies te kweken in mengflora
Bloed toevoegen, selectiever maken, differentieel maken (pH), ab inbouwen
*MaldiTOF massaspectrografie
Matrix-assisted laser desorption/ionization Time of flight (24u)
-> zonder voorkennis de bactgroep identificeren
Identificatiestrategiën verschillend per bact
Kleine hoeveelheid bact op dragen gefixeerd in toestel: met laser gefragmenteerd, eiw in
deeltjes en naar andere kant vd buis gestuurd
-> grote fragmenten gaan traag, kleine fragmenten gaan snel (time of flight)
Registratie via piekenpatroon
Moeilijk kweekbare MO:
- Anaeroben: kweek en transport zonder O2!
- Trage groeiers: mycobact (na weken)
- Niet op klassieke bodems: mycoplasmata (speciale media), chlamydia in cellijnen
- Onkweekbaar of enkel in dier: mycobact leprae, treponema pallidum (syfilis)
- Schimmels en gisten: soms selectieve bodems, soms trage groei
- Virussen: op cellijnen, zichtbaar door cytopathogeen effect of bij
immuundetectie/hybridisatie, soms onkweekbaar -> gespecialiseerde labs
- Protozoa: niet kweekbaar in routine diagnostiek
Interpretatie bact onderzoek: obv klinische vraag, niet alles identificeren!
- Urine: vol commensale bact (400-500)
- Bloed: geen bact dus alles geraporteerd
Vb
keeluitstrijk: strept pyogenes hemolytische kolonies op bloedagar? Nee = ‘banale flora’
Sputum: pneumokok, H influenzae, S. aureus,..
Feces: Salmonella, Campylobacter,… verdachte kolonies op selectieve bodem?
-> nee = stoppen, ja = identificatie pathogenen
, Staaltypes:
wit = potentiele verwekker
zwart = no flora
Type 1: staal afgenomen op plaats zonder no flora
huid desinfecteren, anders contaminatie met huidbewoners
kiem gevonden = pathogeen
vb lumbaalpunctie, hemocultuur/bloedkweek
Type 2: staal afgenomen op plaats zonder no flora, maar passeert een zone met no flora
Vb blaas, bronchi
Maatregelen in labo (bij afnama, transport, verwerking) om pathogenen te zoeken
Type 3: monster met pathogenen tss de bestaande commensale flora
Vb stoelgang, keel, wonde, vagina
Gekende verwekker zoeken op selectieve bodems
Lange analysetijd voor microbiologische onderzoeken (afh van transport, wacht en
rapporteringstijd)
- Microscopie: min – dag
- Kweek + identificatie: 24-48u klassieke testen + 1d, MALDI-TOF zelfde dag
- Autobiogram: 48u
+ evt extra tijd: transport, sluitingstijd labo, langdurige groei pathogenen,…
Virussen, mycobact, mycoplasmata, anaeroben -> trager, complexer
Dus vaak blind starten met therapie, erna bijsturen
- Gebaseerd op PCR (sneller dan groei) -> evolutie naar automatisatie (sequencing)
- Kwantitatief
- Staalvoorbereiding, contaminatie tegengaan
- Voor alle pathogenen
- Zeer specifiek en gevoelig (voor en nadeel)
Bact: direct op staal of combinatie met kweek -> aanw aantonen, R detecteren,
stammen vergelijken, diversiteit flora onderzoeken
Virussen: direct op staal -> aanw aantonen + kwantificeren, virale varianten typeren, R
bepalen op genniveau
Schimmels, protozoa, wormen: direct op staal -> aanw aantonen
