SAMENVATTING
Gentechnologie
2024 - 2025
Abstract
Dit is een samenvatting gemaakt van de ppt slides en notities gemaakt in de
les.
Ook worden er examenvragen in weergegeven.
Lauren Donche
,Hoofdstuk 1: Enzymen uit de
recombinante DNA technologie
HERHALING ENZYMEN:
- Endonucleasen
- Exonucleasen
- Ligasen
- Fosfatasen en kinasen
- DNA polymerasen
- Reverse transcriptase
- Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)
- Topoisomerasen
- Recombinasen
Endonucleasen
= enzymen die DNA en RNA cellen bewerkt door fosfodiësterbindingen te breken
tussen nucleotiden gelegen binnenin de keten.
Voorbeeld: restrictie-endonucleasen
Deze enzymen zijn bijzonder omdat ze specifieke, korte DNA-sequenties (meestal
palindromen) herkennen en precies op die locaties het DNA knippen. Het zijn dus
een soort restrictie-enzymen.
Restrictie-enzymen worden door bacteriën gebruikt om vreemd DNA, zoals dat
van bacteriofagen (virussen), in stukken te knippen en zo te vernietigen. Omdat
DNA universeel is en zowel bacteriën als andere organismen, zoals mensen,
dezelfde basen gebruiken, zouden deze enzymen theoretisch ook het bacteriële
eigen DNA kunnen knippen. Om dit te voorkomen, markeren bacteriën hun eigen
DNA door specifieke plaatsen te methyleren, wat betekent dat er methylgroepen
aan het DNA worden toegevoegd. Deze methylering zorgt ervoor dat het eigen
DNA onherkenbaar wordt voor de restrictie-enzymen, waardoor het beschermd
blijft tegen afbraak. Hierdoor kunnen bacteriën onderscheid maken tussen eigen
en vreemd DNA en hun afweermechanisme effectief gebruiken zonder zichzelf te
beschadigen.
Pagina 1 van 60
,Een schoolvoorbeeld van een soort restrictie-enzym of anders gezegd restrictie-
endonuclease is EcoRI, deze is afkomstig van E.coli.
Dit enzym herkent de sequentie GAATTC (in beide strengen van dsDNA), en knipt
ter hoogte van deze sequentie. Beide strengen worden gekliefd. Omdat de knip
asymmetrisch gepositioneerd is in de herkenningssequentie, ontstaan twee
fragmenten met een 5’ overhang.
Naamgeving restrictie-endonucleasen:
EcoRI BamHI
E = genus Escherichia B = genus Bacillus
co = soort coli am = soort amylolique
faciens
R = stam RY13 H = stam H
I = 1ste geïsoleerde endonuclease I = 1ste geïsoleerde
endonuclease
Verschillende klassen:
Klasse 1 Klasse 2 Klasse 3
- Herkennen specifieke - Herkennen specifieke - Kenmerken van beide
sequenties sequenties types (I en II)
- Knippen ~ 1000-5000 - Knippen beide - Knippen beide
Pagina 2 van 60
, basen verder strengen van het strengen op een
-
Knippen stuk (~75) DNA, dicht bij zekere afstand van de
eruit herkenningssite herkenningssite
- Tweede molecule van - Co-factor: Mg 2+
- Co-factoren: Mg2+ en
het RE nodig om 2de ATP
streng te knippen
- Co-factoren: Mg2+,
ATP en SAM (S-
adenosyl methionine)
Weet dat er in de gentechnologie vooral wordt gewerkt met klasse II restrictie-
enzymen:
- De nuclease en methylase zijn hierbij apart
- Ze herkennen de sequentie en knippen erin dit kan twee verschillende
uitkomsten geven:
o Sticky ends (overhangende eindes)
o Blunt ends (rechte eindes)
- Ze knippen minimum 4bp
De knipplaatsen worden weergegeven tot op de nt
volgens de IUPAC code. De te kennen codes zijn
aangeduid met een rood kader op de afbeelding
hiernaast.
Verschil sticky-ends en blunt-ends:
Sticky ends zijn de uiteinden van een DNA-streng die een overhang (of "sticky"
gedeelte) hebben, oftewel een ongebonden enkele streng van nucleotiden.
Deze worden nog verder onderverdeeld in:
- 5’ overhang: overhang aan 5’
- 3’ overhang: overhang aan 3’
Blunt ends zijn de uiteinden van een DNA-streng waar de knip recht door de
dubbele helix is gegaan, zonder enige overhang van enkele basenparen.
Chimere constructies:
Pagina 3 van 60
Gentechnologie
2024 - 2025
Abstract
Dit is een samenvatting gemaakt van de ppt slides en notities gemaakt in de
les.
Ook worden er examenvragen in weergegeven.
Lauren Donche
,Hoofdstuk 1: Enzymen uit de
recombinante DNA technologie
HERHALING ENZYMEN:
- Endonucleasen
- Exonucleasen
- Ligasen
- Fosfatasen en kinasen
- DNA polymerasen
- Reverse transcriptase
- Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)
- Topoisomerasen
- Recombinasen
Endonucleasen
= enzymen die DNA en RNA cellen bewerkt door fosfodiësterbindingen te breken
tussen nucleotiden gelegen binnenin de keten.
Voorbeeld: restrictie-endonucleasen
Deze enzymen zijn bijzonder omdat ze specifieke, korte DNA-sequenties (meestal
palindromen) herkennen en precies op die locaties het DNA knippen. Het zijn dus
een soort restrictie-enzymen.
Restrictie-enzymen worden door bacteriën gebruikt om vreemd DNA, zoals dat
van bacteriofagen (virussen), in stukken te knippen en zo te vernietigen. Omdat
DNA universeel is en zowel bacteriën als andere organismen, zoals mensen,
dezelfde basen gebruiken, zouden deze enzymen theoretisch ook het bacteriële
eigen DNA kunnen knippen. Om dit te voorkomen, markeren bacteriën hun eigen
DNA door specifieke plaatsen te methyleren, wat betekent dat er methylgroepen
aan het DNA worden toegevoegd. Deze methylering zorgt ervoor dat het eigen
DNA onherkenbaar wordt voor de restrictie-enzymen, waardoor het beschermd
blijft tegen afbraak. Hierdoor kunnen bacteriën onderscheid maken tussen eigen
en vreemd DNA en hun afweermechanisme effectief gebruiken zonder zichzelf te
beschadigen.
Pagina 1 van 60
,Een schoolvoorbeeld van een soort restrictie-enzym of anders gezegd restrictie-
endonuclease is EcoRI, deze is afkomstig van E.coli.
Dit enzym herkent de sequentie GAATTC (in beide strengen van dsDNA), en knipt
ter hoogte van deze sequentie. Beide strengen worden gekliefd. Omdat de knip
asymmetrisch gepositioneerd is in de herkenningssequentie, ontstaan twee
fragmenten met een 5’ overhang.
Naamgeving restrictie-endonucleasen:
EcoRI BamHI
E = genus Escherichia B = genus Bacillus
co = soort coli am = soort amylolique
faciens
R = stam RY13 H = stam H
I = 1ste geïsoleerde endonuclease I = 1ste geïsoleerde
endonuclease
Verschillende klassen:
Klasse 1 Klasse 2 Klasse 3
- Herkennen specifieke - Herkennen specifieke - Kenmerken van beide
sequenties sequenties types (I en II)
- Knippen ~ 1000-5000 - Knippen beide - Knippen beide
Pagina 2 van 60
, basen verder strengen van het strengen op een
-
Knippen stuk (~75) DNA, dicht bij zekere afstand van de
eruit herkenningssite herkenningssite
- Tweede molecule van - Co-factor: Mg 2+
- Co-factoren: Mg2+ en
het RE nodig om 2de ATP
streng te knippen
- Co-factoren: Mg2+,
ATP en SAM (S-
adenosyl methionine)
Weet dat er in de gentechnologie vooral wordt gewerkt met klasse II restrictie-
enzymen:
- De nuclease en methylase zijn hierbij apart
- Ze herkennen de sequentie en knippen erin dit kan twee verschillende
uitkomsten geven:
o Sticky ends (overhangende eindes)
o Blunt ends (rechte eindes)
- Ze knippen minimum 4bp
De knipplaatsen worden weergegeven tot op de nt
volgens de IUPAC code. De te kennen codes zijn
aangeduid met een rood kader op de afbeelding
hiernaast.
Verschil sticky-ends en blunt-ends:
Sticky ends zijn de uiteinden van een DNA-streng die een overhang (of "sticky"
gedeelte) hebben, oftewel een ongebonden enkele streng van nucleotiden.
Deze worden nog verder onderverdeeld in:
- 5’ overhang: overhang aan 5’
- 3’ overhang: overhang aan 3’
Blunt ends zijn de uiteinden van een DNA-streng waar de knip recht door de
dubbele helix is gegaan, zonder enige overhang van enkele basenparen.
Chimere constructies:
Pagina 3 van 60
