Samenvatting H1-H2 - Biotechnologie III

Biotechnologie III
1. Vectoren & kloneringen
1.1. Inleiding
Klonen= aseksueel replicatie van een organismen om genetisch identiek dezelfde organismen te
bekomen
 Uitbreiding:
Klonen gaat ook over een gen of gen fragmenten, niet alleen geheel organisme
= kloneren  een vreemd gen/gen fragment binnen brengen in een bacterie, zodat die het
gen mee verder kopieert
Toepassingen:
 Sequenering van het gen
 Aanmaken van een probe voor expressiescreening
 Expresseren van het gen in de gastheercel. Uitkomst= grote hoeveelheid eiwitproduct
bekomen
 Mutatie van het gen . Uitkomst= veranderde functie van het eiwit bekomen
 Recombinante vector bekomen. Uitkomst= hoger orde organisme transgeen maken

2 benaderingswijzen:
1) Cel gebaseerde DNA-klonering
Gewenste fragment in vivo selectief amplificeren
3 essentiële stappen:
1. Keuze van de geschikte bron van het te kloneren DNA
2. Aanleggen van DNA-fragmenten dat in een gastheer/vector kunnen
geïntroduceerd worden
3. Screenen van de bekomen kolonies voor de aanwezigheid van de gewenste DNA
sequentie
=> Alle bacteriën in dezelfde kolonie bevatten dezelfde plasmiden
2) In vitro DNA-klonering
Gewenste fragment in vitro selectief amplificeren

In vitro versus in vivo
 In vitro= in glas, experimenteren buiten een levend organisme in een beschermde omgeving
 In vivo= in levende, experimenten binnen een levend organisme

1.2. Ligatie
1.2.1. Inleiding
Ligatie= de verbinding tussen de vector en het gen van interesse
Door: enzym DNA ligase
 Nicks (=Enkelstrengige breuken) in DNA herstellen
 Verbindt de 3’ OH groep met de 5’ fosfaatgroep
 Hersteld zowel sticky ends als blunt ends
Uitzonderlijke DNA ligases:
- E. coli DNA ligase  enkel sticky ends verbinden


1

, - T4 DNA liagse  beide maar niet efficiënt voor blut ends
 Vereist ATP (cosubstraat)
 Functie: nicks repareren
 Reactie:
1. Ligase reageert met ATP= covalent enzyme-AMP complex
2. Covalent enzyme-AMP complex reageert met het 5’-fosfaat van het DNA +
AMP wordt overgedragen aan de fosfaat groep
3. 3’OH reageert met het gevormde complex
= covalente foso-diësterverbinding + AMP vrijgesteld
Opletten:
5’fosfaat is noodzakelijk. Als deze afwezig is (kan door fosfatase)= zal het niet werken
=> Fosfatase kan gebruikt worden om zelfsluiting te verhinderen
Ligase heeft nodig:
 DNA
 Mg2+
 Buffer
 ATP
 T4ligase
Reactie= overnacht

1.2.2. Optimalisatie van ligatie-condities
Succes ligatie= verwijst naar de efficiëntie/succes van een ligatiereactie
 Hoeveel fosfo-diësterverbindingen heb ik kunnen vormen
Belangrijk maar onvoorspelbaar
Factoren die succes ligatie verminderen:
- Aanwezigheid van inhibitoren
- Degradatie van het enzym of DNA
- Niet optimale reactie omstandigheden  optimalisatie nodig

Product ligatie= verwijst naar het resultaat van een ligatiereactie
 Hoeveel verschillende producten heb ik nu eigenlijk gevormd

1) Monomoleculaire reactie
= concentratie onafhankelijk
2) Bimoleculaire reactie of intermoleculaire reactie
= de verbinding tussen 2 of meerdere verschillende DNA moleculen
 Vector – insert
3) Intramoleculaire ligatie= de verbinding binnen hetzelfde DNA molecule
 Vector – vector of insert – insert
 Concentratie verhogen van vector, niet van insert= meer kans op
intramoleculaire vector – vector reactie
=> Willen we niet
 Concentratie verhogen van insert, niet van vector= meer kans op
intramoleculaire insert – insert reactie
=> Willen we ook niet, maar minder probleem
Optimale concentratie vector tot insert= 1:3 tot 3:1 voor sticky end
Optimale concentratie vector tot insert= 1:5 voor blunt ends
2 & 3= concentratie afhankelijk  werken met hoge concentraties

2

,Molaire ratio berekenen:
(Wv / Sv) : (Wi / Si)
 Wv= gewicht vector (ng)
 Sv= grootte vector (bp)
 Wi= gewicht insert (ng)
 Si= grootte insert (bp)
Oriëntatie van het insert is ook belangrijk => niet gecontroleerd

1.2.3. Voorkomen van ongewenste ligatie: alkalische fosfatase en
dubbeldigeste
2 andere methoden om ongewenste ligatie te voorkomen:
- 5’fosfaatgroep verwijderen van de vector  zelfsluiting vermijden
- Toepassen van een dubbele restrictie-digest
1.2.3.1. Defosforylatie van de vector
Verwijderen van 5’fosfaat van DNA, RNA, ribo- en deoxyribonucleosidetrifosfaten door:
- BAP= bacterieel alkalisch fosfatase
- CIP= kalf intestinaal fosfatase
= zelfsluiting van de vector wordt onmogelijk
 Ligatie met een insert wel nog, insert heeft zijn 5’ fosfaat nog
Verwijderen van fosfaat VOOR DE LIGATIE
 Anders verliest het insert ook zijn 5’fosfaatgroep
 In-activatie van het fosfatase= onbetrouwbaar
Dus:
- DNA uit het mengsel halen door:
 Anionuitwisselingschromatografie
 Fenolextractie gevolgd door een ethanolprecipitatie
Na de ligatie:
 Ligatieproduct met 2 nicks= geen probleem
Blijft stabiel door de waterstofbruggen van de basenparing
 Wanneer het plasmide getransformeerd wordt, hersteld de bacterie deze nicks bij de
dochtercellen tijdens de replicatie
(Toevoegen van de ontbrekende fosfatasen)
= plasmide wordt vermenigvuldigd in een volledig intacte vorm
1.2.3.2. Defosforylatie van het insert
Bij een heterogeen insert pool (= genomische bank)
 Defosforyleren van het insert in plaats van de vector
Ook met :
- BAP
- CIP
= geen multimeren van de inserts kunnen gevormd worden
Multimeren van de inserts= zijn DNA-fragmenten die in meerdere kopieën in een vector zijn
ingebracht tijdens een kloneringsproces

Wel: zelfsluiting van de vector mogelijk
 Vermijden door:
Vectoren te gebruiken die enkel tot succesvol getransformeerde bacteriën kunnen leiden


3

, 1.2.3.3. Dubbele restrictie-digest
 De 2 elementen voor de ligatie telkens met 2 restrictie-enzymen laten knippen
= ontstaan van niet-compatibele sticky ends
 Vaan in MCS= Multiple Cloning Site
Waarom daar?
=> Er is niets van belang aanwezig
Extra stap nodig voor de kloenring met vector?
=> Kleine stukje en de rest van de vector moeten gescheiden worden van elkaar door
preparatieve gel elektroforese
Voordelen:
- De oriëntatie van het insert blijft gecontroleerd tijdens de ligatie
- Zelfsluiting van de vector voorkomen
- Insertie van multimere inserts voorkomen




1.3. Modificatie van DNA uiteinden
Modificatie= het aanpassen van de DNA uiteinden via restrictie-enzymen
Restrictie enzymen kunnen:
- 5’ overhangende ends creëren
- 3’ overhangende ends creëren

1.3.1. Conversie van 3’-uitstekende eindjes tot even eindjes (blut ends)
 Verwijderen of opvullen tot een stomp einde
Door: T4 polymerase of klenow fragment (= afgeleid enzym van DNA-polymerase I)
- 5’  3’ polymerase activiteit
Synthetiseert nucleotiden
- 3’  5’ exonuclease activiteit
Uitstekende nucleotiden worden verwijderd
- Trifosfaten verhinderd een overdreven exonuclease activiteit
- Enzym heef nodig voor de werking:

4