Onderstaande vragen zijn een leidraad voor het studeren voor het examen van DNA technologie. Ze
dienen als hulpmiddel om te controleren of je de gestudeerde leerstof voldoende onder de knie
hebt.
Hoofdstuk 1. Cispr/Cas
Leg uit hoe je een gen kan editen met Crispr-Cas ahv 2 grote stappen. Je kan het mechanisme van
iedere stap volledig beschrijven.
Dubbelstrengige breuk induceren op seq-specifieke wijze.
o Vormen van sgRNA gaat cas9 binden om een complex te vormen
Interactie met cas9 door transactiverend crisis RNA
o Herkenning PAM(protospacer adjacent motief)=> ontwinding van DNA treed op.
Cas9 bind aan PAM sequentie
o Interactie tussen crRNA gedeelte van sgRNA met doelDNA( geen complementariteit=
geen DSB)
Herkent+ bind doel DNA
Gebonden Cas9 zorgt voor denaturatie
o Introduceren DSB.
HNH domein knipt DNA streng waar sgRNA gebonden is.
En RuvC domein knipt DNA naast de PAM site.
DSB ontstaan
Herstel DSB
o Nonhomologous end joining of NHEJ:
o Opletten voor deleties en inserties tijdens chemisch herverbinden = onnauwkeurig.
o Voor knock-out van genen in eukaryoten cellen ( enkel eukaryoten)
Of
o Homology direct repair
o Homologe recombinatie (kan dicht gelokaliseerd zijn of kan extern toegevoed
template zijn.
Voor knock-in van DNA-sequenties en kan dus specifieke gencorrecties
invoeren
,Bespreek de verschillende onderdelen van Crispr-Cas die aanleiding geven tot een DSB en hun functie
tot in detail.
RuvC nuclease domein: knipt DNA streng 3 bp “upstream” van protospacer adjacent motif
(PAM) sequentie (NGG)
HNH nuclease domein: knipt DNA streng die complementair is en basenpaart met het sgRNA
Je legt het werkingsmechanisme van Cripsr/cas9 uit ahv een gegeven tekening.
sgRNA bind aan Cas 9 —> complex vormen
Target DNA bind aan NUC lobe waarbij PAM in PI-domein zit.
HNH domein ondergaat conformationele wijziging waardoor target DNA gaadt binden met
seed regio (=CrRNA)
DNA seperatie en RNA invasie
DSB gevromd
,Je kan de 2 herstelmechanismen van een DSB uitleggen. Hoe kan je een gen toevoegen met
CrisprCas? Hoe kan je frameshift creëren in je ORF met Crispr-Cas opdat je een niet functioneel gen
Bekomt? Hoe kan je een puntmutatie introduceren ahv Crispr-Cas (op 2 manieren!)?
1. Niet homologe end joining = einde aan elkaar gemaakt zonder homologe template dmv DNA
Ligase
- Door ligatie van overhangende uiteinde die niet compatibel zijn kunnen er deleties,
inserties onstaan die zorgen voor een leesraam verschuiving.
2. HDR = homologe direct repair ( homologe recombinatie)
- Nauwkeurig herstel omdat er sequenties gebruikt worden die identiek zijn aan de
uiteinden van de gevormde breuk
- Zuster chromatine of homoloog chromosoom gebrukt of een extern donor DNA template
met specifieke inserties of deleties waardoor je een gen kan toevoegen.
Je kent de verschillende strategieën voor het verkrijgen van een functioneel Cas9-sgRNA
ribonucleoproteïne in de celkern met hun voor-of nadeel.
1. DNA-plasmide
a. Cas9 DNA en sgDNA ingebracht via DNA plasmide en naar nucleus getransporteerd.
b. Transcriptie naar Cas 9 mRNA en sg RNA
c. Transport mRNA naar cytosol=> translatie naar Cas 9 eiwit
d. Assemblage Cas9 eiwit en sgRNA=> terug naar kern waar het genetische modificaties
kan verichten
i. Voordeel:
a. Zeer stabiele expressie
ii. Nadeel:
a. Zowel transcriptie als translatie nodig=> vertragen
therapeutisch effect
b. Lange expressieduur want DNA plasmide zeer stabiel: meer
risico op immuun respons
c. Duurt langer want over 2 membranen
, 2. mRNA en sgRNA cargo
a. Cas—mRNA en sg RNA in cytoplasma gebracht.
b. Onmiddelijke translatie van Cas9 mRNA tot Cas9 eiwit zonder tarnscriptie
c. Assemblage van Cas9 eiwit en sgRNA + transport naar kern=> modificatie aan
brengen
i. Voordeel:
a. Snel Therapeutisch effect, geen transcriptie
b. Kortere expressie door cellulaire degradatie van RNA
fragmenten, ook betere controle overconcentratie en
expressieduur
ii. Nadeel:
a. Snelle degradatie waardoor geen efficiënte genmodificatie
mogelijk is tenzij gewerkt wordt met chemisch
gemodificeerde RNA moleculen die de stabiliteit van RNA
verbeteren
3. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine cargo
a. Cas9-sgRNA ribonucleoproteincomplex wordt in cytoplasma aangeleverd
b. Enkel transport naar de kern nodig waar het complex vervolgens genetische
modificaties kan aanbrengenin het gDNA
i. Voordeel:
a. Onmiddellijk therapeutsich effect
ii. Nadeel:
a. Snelle degradatie + lage efficiëntie (2 membranen
overbruggen)
Je kan de verschillende onderdelen van een gegeven Crispr/cas vector uitleggen. (Niet volledig)
T7: promotor voor sequentie -specifieke….
Cas9/2A/GFP: Cas9/GFP eiwit verbonden door 2A en NLS (nucleair localisatiesignaal)
U6: Onder controle van U6 RNA pol vooral voor hairpins dus om sgRNA over te schrijven
CMV cytmegalovirus promotor: RNA pol promoter=> hele lange RNA maken
dienen als hulpmiddel om te controleren of je de gestudeerde leerstof voldoende onder de knie
hebt.
Hoofdstuk 1. Cispr/Cas
Leg uit hoe je een gen kan editen met Crispr-Cas ahv 2 grote stappen. Je kan het mechanisme van
iedere stap volledig beschrijven.
Dubbelstrengige breuk induceren op seq-specifieke wijze.
o Vormen van sgRNA gaat cas9 binden om een complex te vormen
Interactie met cas9 door transactiverend crisis RNA
o Herkenning PAM(protospacer adjacent motief)=> ontwinding van DNA treed op.
Cas9 bind aan PAM sequentie
o Interactie tussen crRNA gedeelte van sgRNA met doelDNA( geen complementariteit=
geen DSB)
Herkent+ bind doel DNA
Gebonden Cas9 zorgt voor denaturatie
o Introduceren DSB.
HNH domein knipt DNA streng waar sgRNA gebonden is.
En RuvC domein knipt DNA naast de PAM site.
DSB ontstaan
Herstel DSB
o Nonhomologous end joining of NHEJ:
o Opletten voor deleties en inserties tijdens chemisch herverbinden = onnauwkeurig.
o Voor knock-out van genen in eukaryoten cellen ( enkel eukaryoten)
Of
o Homology direct repair
o Homologe recombinatie (kan dicht gelokaliseerd zijn of kan extern toegevoed
template zijn.
Voor knock-in van DNA-sequenties en kan dus specifieke gencorrecties
invoeren
,Bespreek de verschillende onderdelen van Crispr-Cas die aanleiding geven tot een DSB en hun functie
tot in detail.
RuvC nuclease domein: knipt DNA streng 3 bp “upstream” van protospacer adjacent motif
(PAM) sequentie (NGG)
HNH nuclease domein: knipt DNA streng die complementair is en basenpaart met het sgRNA
Je legt het werkingsmechanisme van Cripsr/cas9 uit ahv een gegeven tekening.
sgRNA bind aan Cas 9 —> complex vormen
Target DNA bind aan NUC lobe waarbij PAM in PI-domein zit.
HNH domein ondergaat conformationele wijziging waardoor target DNA gaadt binden met
seed regio (=CrRNA)
DNA seperatie en RNA invasie
DSB gevromd
,Je kan de 2 herstelmechanismen van een DSB uitleggen. Hoe kan je een gen toevoegen met
CrisprCas? Hoe kan je frameshift creëren in je ORF met Crispr-Cas opdat je een niet functioneel gen
Bekomt? Hoe kan je een puntmutatie introduceren ahv Crispr-Cas (op 2 manieren!)?
1. Niet homologe end joining = einde aan elkaar gemaakt zonder homologe template dmv DNA
Ligase
- Door ligatie van overhangende uiteinde die niet compatibel zijn kunnen er deleties,
inserties onstaan die zorgen voor een leesraam verschuiving.
2. HDR = homologe direct repair ( homologe recombinatie)
- Nauwkeurig herstel omdat er sequenties gebruikt worden die identiek zijn aan de
uiteinden van de gevormde breuk
- Zuster chromatine of homoloog chromosoom gebrukt of een extern donor DNA template
met specifieke inserties of deleties waardoor je een gen kan toevoegen.
Je kent de verschillende strategieën voor het verkrijgen van een functioneel Cas9-sgRNA
ribonucleoproteïne in de celkern met hun voor-of nadeel.
1. DNA-plasmide
a. Cas9 DNA en sgDNA ingebracht via DNA plasmide en naar nucleus getransporteerd.
b. Transcriptie naar Cas 9 mRNA en sg RNA
c. Transport mRNA naar cytosol=> translatie naar Cas 9 eiwit
d. Assemblage Cas9 eiwit en sgRNA=> terug naar kern waar het genetische modificaties
kan verichten
i. Voordeel:
a. Zeer stabiele expressie
ii. Nadeel:
a. Zowel transcriptie als translatie nodig=> vertragen
therapeutisch effect
b. Lange expressieduur want DNA plasmide zeer stabiel: meer
risico op immuun respons
c. Duurt langer want over 2 membranen
, 2. mRNA en sgRNA cargo
a. Cas—mRNA en sg RNA in cytoplasma gebracht.
b. Onmiddelijke translatie van Cas9 mRNA tot Cas9 eiwit zonder tarnscriptie
c. Assemblage van Cas9 eiwit en sgRNA + transport naar kern=> modificatie aan
brengen
i. Voordeel:
a. Snel Therapeutisch effect, geen transcriptie
b. Kortere expressie door cellulaire degradatie van RNA
fragmenten, ook betere controle overconcentratie en
expressieduur
ii. Nadeel:
a. Snelle degradatie waardoor geen efficiënte genmodificatie
mogelijk is tenzij gewerkt wordt met chemisch
gemodificeerde RNA moleculen die de stabiliteit van RNA
verbeteren
3. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine cargo
a. Cas9-sgRNA ribonucleoproteincomplex wordt in cytoplasma aangeleverd
b. Enkel transport naar de kern nodig waar het complex vervolgens genetische
modificaties kan aanbrengenin het gDNA
i. Voordeel:
a. Onmiddellijk therapeutsich effect
ii. Nadeel:
a. Snelle degradatie + lage efficiëntie (2 membranen
overbruggen)
Je kan de verschillende onderdelen van een gegeven Crispr/cas vector uitleggen. (Niet volledig)
T7: promotor voor sequentie -specifieke….
Cas9/2A/GFP: Cas9/GFP eiwit verbonden door 2A en NLS (nucleair localisatiesignaal)
U6: Onder controle van U6 RNA pol vooral voor hairpins dus om sgRNA over te schrijven
CMV cytmegalovirus promotor: RNA pol promoter=> hele lange RNA maken
