Moleculaire Biologie
Samenvatting
2022-2023
[Trek de aandacht van uw lezer met een interessante samenvatting. Dit is meestal een kort
overzicht van het document.
Wanneer u uw inhoud wilt toevoegen, klikt u hier en begint u te typen.]
[E-mailadres]
,Milana Vlogaert 2MLTc
H1 Isolatie van nucleïnezuren
1.1. Leerdoelen
1.2. Isolatie van nucleïnezuren
• Doel → isoleren (= opzuiveren) van DNA uit cellen/weefsels
• Belang:
− Zuiver DNA nodig voor enzymatische ‘down stream’ toepassingen
− Enzymwerking wordt verstoord wanneer DNA niet zuiver is
− Hoe zuiverder, hoe beter je kan bewaren
• Principe:
a) Cellyse = homogeniseren van het monster
b) Verwijderen van ongewenste componenten
c) Bewaren van geïsoleerd DNA
d) Kwaliteitscontrole van geïsoleerde DNA (kwalitatief en kwantitatief)
1. Hoe kunnen we cellen openbreken om er DNA uit te isoleren?
• Lyse methode → afhankelijk van staaltype (grote diversiteit in cel architectuur
Het is ook afhankelijk van de cel, heeft deze een celwand of enkel een celmembraan
Bij de celwand maken we een onderscheid tussen gram + en gram –
We kunnen cellen openbreken op verschillende manieren:
▪ Chemisch
Detergens → maakt celmembraan kapot (SDS)
Alkalische buffer (NaOH)
▪ Biologisch
1
,Milana Vlogaert 2MLTc
Proteïnase K → breekt EW af uit celmembraan en EW
gebonden op nucleïnezuren → Het gaat EW degraderen en
nucleasen onschadelijk maken
Eigenschappen van proteïnase K:
✓ Breed-spectrum proteïnase
✓ Knipt na hydrofobe AZ
✓ Temperatuurprofiel
✓ Stabiel over een breed pH-bereik
✓ Werking wordt verhoogd door detergenten en chaotrope
stoffen (denatureren substraat → enzym heeft meer
toegankelijkheid)
De activiteit van proteïnase K wordt verhoogd
o Lysozyme →hydrolyseert peptidoglycaan breekt celwand
van grampositieven open
o Detergenten en chaotrope stoffen
Chaotroop agens = verhoogt de entropie in biologische systemen door te interfereren met
intermoleculaire krachten zoals waterstofbruggen, van der waals krachten en hydrofobe
effecten
Ze hebben een effect op biomoleculen:
• Verbreken de watermantel rond DNA
• Denatureren EW
• Beschermen DNA door inactivatie van nucleasen
• Verhogen membraanpermeabiliteit door het hydrofobe effect te
verstoren
Hydrofoob effect = de neiging van apolaire stoffen om te aggregeren in een waterige
oplossing en watermoleculen uit te sluiten. Het vormt het celmembraan
en het zorgt voor het correct vouwen van EW tot functionele
structuren.
▪ Fysisch (warmte, osmose)
▪ Mechanisch (vortex, soniceren)
▪ Combinatie van verschillende methodes
HUMANE CELLEN: proteïnase K, detergent, warmte,
chaotrope stof/zout (in lysebuffer)
BACTERIËN: NaOH en warmte
2
, Milana Vlogaert 2MLTc
2. Hoe zuiveren we het DNA? Hoe verwijderen we de overige componenten?
Het cellystaat bevat: DNA in waterige oplossing, RNA in waterige oplossing, afbreekbaar
materiaal van de cel, detergent, proteïnase K, chaotoop agens …
Er zijn verschillende DNA-isolatie technologieën:
• Vroeger: Fenol-chloroform extractie → fenol is chaoptroop
• Nu: kolomchromatografie
Bij een extractie hebben we verschillende lagen:
• Waterige fase (DNA)
• Interfase (celdebris)
• Organische fase (EW, lipiden)
Vroeger: Fenol-chloroform extractie (schadelijk)
→ isopropanol precipitatie om DNA te concentreren
• Voordelen:
o Zeer zuiver DNA
o Zeer goed opbrengst
• Nadelen:
o Tijdrovend
o Isopropanol precipitatie
o Schadelijke organische solventen
o Residuele organische solventen interfereren met DNA-
concentratiebepaling en enzymatische DNA-manipulatie
Sinds 1990: Boom-‘extractie’ = kolomchromatografie
1. Absorptie van DNA op silicagel
o De bindingsbuffer heeft een hoge zoutconcentratie en chaotroop agens
o Functie van buffer:
− Verwijderen watermantel van DNA
− Verwijderen watermantel van kolom
− Vormen kationbrug tussen silicakolom en negatief geladen DNA
2. Verwijderen van contaminanten (= wassen, flow trough)
o Wassen met ethanol (chaotrop) en hoge zoutconcentratie
o DNA blijft gebonden aan kolom
3
Samenvatting
2022-2023
[Trek de aandacht van uw lezer met een interessante samenvatting. Dit is meestal een kort
overzicht van het document.
Wanneer u uw inhoud wilt toevoegen, klikt u hier en begint u te typen.]
[E-mailadres]
,Milana Vlogaert 2MLTc
H1 Isolatie van nucleïnezuren
1.1. Leerdoelen
1.2. Isolatie van nucleïnezuren
• Doel → isoleren (= opzuiveren) van DNA uit cellen/weefsels
• Belang:
− Zuiver DNA nodig voor enzymatische ‘down stream’ toepassingen
− Enzymwerking wordt verstoord wanneer DNA niet zuiver is
− Hoe zuiverder, hoe beter je kan bewaren
• Principe:
a) Cellyse = homogeniseren van het monster
b) Verwijderen van ongewenste componenten
c) Bewaren van geïsoleerd DNA
d) Kwaliteitscontrole van geïsoleerde DNA (kwalitatief en kwantitatief)
1. Hoe kunnen we cellen openbreken om er DNA uit te isoleren?
• Lyse methode → afhankelijk van staaltype (grote diversiteit in cel architectuur
Het is ook afhankelijk van de cel, heeft deze een celwand of enkel een celmembraan
Bij de celwand maken we een onderscheid tussen gram + en gram –
We kunnen cellen openbreken op verschillende manieren:
▪ Chemisch
Detergens → maakt celmembraan kapot (SDS)
Alkalische buffer (NaOH)
▪ Biologisch
1
,Milana Vlogaert 2MLTc
Proteïnase K → breekt EW af uit celmembraan en EW
gebonden op nucleïnezuren → Het gaat EW degraderen en
nucleasen onschadelijk maken
Eigenschappen van proteïnase K:
✓ Breed-spectrum proteïnase
✓ Knipt na hydrofobe AZ
✓ Temperatuurprofiel
✓ Stabiel over een breed pH-bereik
✓ Werking wordt verhoogd door detergenten en chaotrope
stoffen (denatureren substraat → enzym heeft meer
toegankelijkheid)
De activiteit van proteïnase K wordt verhoogd
o Lysozyme →hydrolyseert peptidoglycaan breekt celwand
van grampositieven open
o Detergenten en chaotrope stoffen
Chaotroop agens = verhoogt de entropie in biologische systemen door te interfereren met
intermoleculaire krachten zoals waterstofbruggen, van der waals krachten en hydrofobe
effecten
Ze hebben een effect op biomoleculen:
• Verbreken de watermantel rond DNA
• Denatureren EW
• Beschermen DNA door inactivatie van nucleasen
• Verhogen membraanpermeabiliteit door het hydrofobe effect te
verstoren
Hydrofoob effect = de neiging van apolaire stoffen om te aggregeren in een waterige
oplossing en watermoleculen uit te sluiten. Het vormt het celmembraan
en het zorgt voor het correct vouwen van EW tot functionele
structuren.
▪ Fysisch (warmte, osmose)
▪ Mechanisch (vortex, soniceren)
▪ Combinatie van verschillende methodes
HUMANE CELLEN: proteïnase K, detergent, warmte,
chaotrope stof/zout (in lysebuffer)
BACTERIËN: NaOH en warmte
2
, Milana Vlogaert 2MLTc
2. Hoe zuiveren we het DNA? Hoe verwijderen we de overige componenten?
Het cellystaat bevat: DNA in waterige oplossing, RNA in waterige oplossing, afbreekbaar
materiaal van de cel, detergent, proteïnase K, chaotoop agens …
Er zijn verschillende DNA-isolatie technologieën:
• Vroeger: Fenol-chloroform extractie → fenol is chaoptroop
• Nu: kolomchromatografie
Bij een extractie hebben we verschillende lagen:
• Waterige fase (DNA)
• Interfase (celdebris)
• Organische fase (EW, lipiden)
Vroeger: Fenol-chloroform extractie (schadelijk)
→ isopropanol precipitatie om DNA te concentreren
• Voordelen:
o Zeer zuiver DNA
o Zeer goed opbrengst
• Nadelen:
o Tijdrovend
o Isopropanol precipitatie
o Schadelijke organische solventen
o Residuele organische solventen interfereren met DNA-
concentratiebepaling en enzymatische DNA-manipulatie
Sinds 1990: Boom-‘extractie’ = kolomchromatografie
1. Absorptie van DNA op silicagel
o De bindingsbuffer heeft een hoge zoutconcentratie en chaotroop agens
o Functie van buffer:
− Verwijderen watermantel van DNA
− Verwijderen watermantel van kolom
− Vormen kationbrug tussen silicakolom en negatief geladen DNA
2. Verwijderen van contaminanten (= wassen, flow trough)
o Wassen met ethanol (chaotrop) en hoge zoutconcentratie
o DNA blijft gebonden aan kolom
3
