Geïntegreerd practicum EXAMEN
Gebruikte stoffen
0,9% NaCl Wordt gebruikt om de mond te spoelen. Is een isotone oplossing, dus
de cellen zullen niet openbreken.
Lysisbuffer Zorgt ervoor dat de cel kan openbreken.
Samenstelling:
Tris -> zorgt voor stabilisatie van pH
EDTA -> chelator die cofactoren zal binden zodat DNA intact blijft en
niet worden afgebroken door de DNases
NaCl -> stabiliseert de ladingen van DNA waardoor de interactie tussen
DNA en water neutraliseert
2% SDS -> detergent dat celmembranen openbreekt
Proteïnase K Zorgt voor afbraak van nucleases -> DNA beschermen
Verzadigd NaCl Zorgt ervoor dat de eiwitten gaan neerslaan en zo gescheiden kunnen
worden van de nucleotiden die niet neerslaan .
Absolute ethanol Zorgt ervoor dat het DNA zal neerslaan.
70% ethanol Dient als overgangsstap tussen absolute ethanol en water, zodat het
niet een te groot verschil is.
TE-4 buffer Zorgt voor het oplossen van het DNA en biedt bescherming van de
nucleïnezuren tegen enzymatische lysis.
Samenstelling:
EDTA
Tris-HCl -> Tris dient als buffercomponent, HCl verlaagt de pH
Agarose Polysacharide dat gebruikt wordt in de gel waarop de stalen worden
geladen.
TBE buffer Zorgt ervoor dat het DNA gedeprotoneerd blijft en opgelost blijft in
water door het stabiel houden van de pH (rond pH 8,3).
Samenstelling:
Tris
Boraat/boorzuur -> het vormt samen met Tris een buffer om de pH te
stabiliseren en het helpt bij het cross-linken van de agarose gelmatrix.
EDTA
GelRed Wordt gebruikt om DNA te visualiseren.
SLM Sample Loading Mix
Samenstelling:
EDTA
20% SDS -> geeft een negatieve lading aan het staal waardoor deze
naar de positieve pool van de elektroforese zal migreren
Sucrose -> maakt het staal zwaarder waardoor het naar beneden zal
zakken op de gel
Broomfenolblauw -> zorgt voor visualisatie van het staal, het bindt niet
aan het staal en heeft een gelijkaardige snelheid waarmee het over de
gel migreert dus dient het als indicator van waar het staal zich bevindt
Steriel water Oplosmiddel
PCR-buffer (kleurloos) Creëert een optimaal milieu voor de reactie, de kleurloze buffer wordt
gebruikt omdat er nog verder gewerkt moet worden met het PCR-
product.
MgCl2 Fungeert als een cofactor in de PCR-reactie, versterkt de enzymatische
activiteit van DNA-polymerase.
Forward primer en Binden op een stukje template DNA, worden gebruikt om het stuk DNA
reverse primer af te bakenen dat geamplificeerd moet worden.
, dNTP’s Bestaat uit de 4 basisnucleotiden (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
bouwstenen voor de nieuwe DNA-strengen.
DNA Taq polymerase DNA-polymerase dat bestand is tegen hoge temperaturen, zal nieuwe
nucleotiden rekruteren om een nieuwe streng te vormen.
PCR-buffer (groen) Creëert een optimaal milieu voor de reactie, in deze buffer zit al
ladingsbuffer. Hier kunnen mogelijk downstream effecten optreden
dus zal alleen gebruikt worden als er niet verder met het PCR-product
gewerkt moet worden.
Na acetaat Helpt bij het neerslaan van DNA, wordt gebruikt i.c.m. ethanol.
pUC19 controle vector Bevat een gen dat codeert voor resistentie tegen ampicilline, wordt
gebruikt om de transformatie efficiëntie te bepalen.
SOC-medium Super Optimal Broth with Catabolite repression medium is een glucose-
rijk groeimedium.
Samenstelling:
Tryptone -> voorziet voedingsstoffen zoals aminozuren en peptiden
Gistextract -> voedingsbron voor bacterien
NaCl -> zorgt voor een osmostische balans en stabiele pH
KCl -> zorgt voor een osmostische balans en stabiele pH
Magnesiumionen -> essentieel voor herstel van celmembranen van de
E. coli na de hitteshock, cruciaal voor behoud van integriteit van
membranen en activiteit van DNA-herstelenzymen
Glucose -> fungeert als een snel metaboliseerbare koolstofbron (snelle
energiebron)
Zoutoplossing Zal de negatieve ladingen neutraliseren waardoor PCR-product en
plasmide vector dichter bij elkaar komen.
X-gal Is aanwezig in de agar en wordt gebruikt om bacteriën te identificeren
die β-galactosidase produceren. X-gal is kleurloos, maar wanneer β-
galactosidase aanwezig zal X-gal afgebroken worden en zo een blauw
product vormen.
IPTG Verwijdert de repressor van lac-operon om genexpressie te
introduceren, staat voor Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside.
Ampicilline Antibioticum
LB-medium Lysogeny broth is een voedingsrijk groeimedium.
Samenstelling:
Tryptone
Gistextract
NaCl
Suspensiebuffer Zorgt ervoor dat de pellet opgelost kan worden. Komt uit de High Pure
Plasmid Isolation Kit.
Samenstelling:
Tris-HCl
EDTA
RNase A -> enzym dat RNA afbreekt om het DNA op te zuiveren
Lyse buffer Zorgt voor het openbreken van de cellen zodat plasmide-DNA vrijkomt.
Komt uit de High Pure Plasmid Isolation Kit.
Samenstelling:
SDS
NaOH -> zorgt voor verhoging pH en denatureert DNA en eiwitten
alsook afbreken celwanden.
Gebruikte stoffen
0,9% NaCl Wordt gebruikt om de mond te spoelen. Is een isotone oplossing, dus
de cellen zullen niet openbreken.
Lysisbuffer Zorgt ervoor dat de cel kan openbreken.
Samenstelling:
Tris -> zorgt voor stabilisatie van pH
EDTA -> chelator die cofactoren zal binden zodat DNA intact blijft en
niet worden afgebroken door de DNases
NaCl -> stabiliseert de ladingen van DNA waardoor de interactie tussen
DNA en water neutraliseert
2% SDS -> detergent dat celmembranen openbreekt
Proteïnase K Zorgt voor afbraak van nucleases -> DNA beschermen
Verzadigd NaCl Zorgt ervoor dat de eiwitten gaan neerslaan en zo gescheiden kunnen
worden van de nucleotiden die niet neerslaan .
Absolute ethanol Zorgt ervoor dat het DNA zal neerslaan.
70% ethanol Dient als overgangsstap tussen absolute ethanol en water, zodat het
niet een te groot verschil is.
TE-4 buffer Zorgt voor het oplossen van het DNA en biedt bescherming van de
nucleïnezuren tegen enzymatische lysis.
Samenstelling:
EDTA
Tris-HCl -> Tris dient als buffercomponent, HCl verlaagt de pH
Agarose Polysacharide dat gebruikt wordt in de gel waarop de stalen worden
geladen.
TBE buffer Zorgt ervoor dat het DNA gedeprotoneerd blijft en opgelost blijft in
water door het stabiel houden van de pH (rond pH 8,3).
Samenstelling:
Tris
Boraat/boorzuur -> het vormt samen met Tris een buffer om de pH te
stabiliseren en het helpt bij het cross-linken van de agarose gelmatrix.
EDTA
GelRed Wordt gebruikt om DNA te visualiseren.
SLM Sample Loading Mix
Samenstelling:
EDTA
20% SDS -> geeft een negatieve lading aan het staal waardoor deze
naar de positieve pool van de elektroforese zal migreren
Sucrose -> maakt het staal zwaarder waardoor het naar beneden zal
zakken op de gel
Broomfenolblauw -> zorgt voor visualisatie van het staal, het bindt niet
aan het staal en heeft een gelijkaardige snelheid waarmee het over de
gel migreert dus dient het als indicator van waar het staal zich bevindt
Steriel water Oplosmiddel
PCR-buffer (kleurloos) Creëert een optimaal milieu voor de reactie, de kleurloze buffer wordt
gebruikt omdat er nog verder gewerkt moet worden met het PCR-
product.
MgCl2 Fungeert als een cofactor in de PCR-reactie, versterkt de enzymatische
activiteit van DNA-polymerase.
Forward primer en Binden op een stukje template DNA, worden gebruikt om het stuk DNA
reverse primer af te bakenen dat geamplificeerd moet worden.
, dNTP’s Bestaat uit de 4 basisnucleotiden (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
bouwstenen voor de nieuwe DNA-strengen.
DNA Taq polymerase DNA-polymerase dat bestand is tegen hoge temperaturen, zal nieuwe
nucleotiden rekruteren om een nieuwe streng te vormen.
PCR-buffer (groen) Creëert een optimaal milieu voor de reactie, in deze buffer zit al
ladingsbuffer. Hier kunnen mogelijk downstream effecten optreden
dus zal alleen gebruikt worden als er niet verder met het PCR-product
gewerkt moet worden.
Na acetaat Helpt bij het neerslaan van DNA, wordt gebruikt i.c.m. ethanol.
pUC19 controle vector Bevat een gen dat codeert voor resistentie tegen ampicilline, wordt
gebruikt om de transformatie efficiëntie te bepalen.
SOC-medium Super Optimal Broth with Catabolite repression medium is een glucose-
rijk groeimedium.
Samenstelling:
Tryptone -> voorziet voedingsstoffen zoals aminozuren en peptiden
Gistextract -> voedingsbron voor bacterien
NaCl -> zorgt voor een osmostische balans en stabiele pH
KCl -> zorgt voor een osmostische balans en stabiele pH
Magnesiumionen -> essentieel voor herstel van celmembranen van de
E. coli na de hitteshock, cruciaal voor behoud van integriteit van
membranen en activiteit van DNA-herstelenzymen
Glucose -> fungeert als een snel metaboliseerbare koolstofbron (snelle
energiebron)
Zoutoplossing Zal de negatieve ladingen neutraliseren waardoor PCR-product en
plasmide vector dichter bij elkaar komen.
X-gal Is aanwezig in de agar en wordt gebruikt om bacteriën te identificeren
die β-galactosidase produceren. X-gal is kleurloos, maar wanneer β-
galactosidase aanwezig zal X-gal afgebroken worden en zo een blauw
product vormen.
IPTG Verwijdert de repressor van lac-operon om genexpressie te
introduceren, staat voor Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside.
Ampicilline Antibioticum
LB-medium Lysogeny broth is een voedingsrijk groeimedium.
Samenstelling:
Tryptone
Gistextract
NaCl
Suspensiebuffer Zorgt ervoor dat de pellet opgelost kan worden. Komt uit de High Pure
Plasmid Isolation Kit.
Samenstelling:
Tris-HCl
EDTA
RNase A -> enzym dat RNA afbreekt om het DNA op te zuiveren
Lyse buffer Zorgt voor het openbreken van de cellen zodat plasmide-DNA vrijkomt.
Komt uit de High Pure Plasmid Isolation Kit.
Samenstelling:
SDS
NaOH -> zorgt voor verhoging pH en denatureert DNA en eiwitten
alsook afbreken celwanden.
