Samenvatting HCO2, regulatie microtubuli dynamiek

HCO2, regulatie microtubuli dynamica
+TIPs, in Utrecht doen ze o.a. onderzoek naar eiwitten die aan de uiteinden van microtubuli
binden en daar krimp of groei reguleren. Er is een grote groep aan eiwitten die zich concentreert
aan het einde van microtubuli en deze noemen we +TIPs. Rechts zie je een beeld van een
opname waarbij microtubuli rood zijn en EB3 (end binding protein 3) groen fluorescent is
gelabeld. Door fusie eiwitten te maken zoals EB3-GFP kan je live cell imaging video’s maken
waar je duidelijk kan zien dat de meeste microtubuli vanuit het centrosoom groeien (𝛾-ringen). Dit is
echter niet de enige plek waar nucleatie kan plaatsvinden.
FRAP, fluorescence recovery after photobleaching, in een onderzoek hebben ze met een sterke
laser photobleaching uitgeoefend op een groeiend microtubuli einde om te kijken hoelang het
duurt voor +TIPs uitgewisseld worden. Bij fotobleking maak je de eiwitten niet kapot, maar
verliezen ze enkel de fluorescentie. Je merkt bijna niks aan de groeiende komeetje en de
bleekgemaakte moleculen worden dus snel vervangen door fluorescente moleculen die in de
omgeving zaten. Deze waren eerst niet meer zichtbaar, maar wel als ze samen klusteren op het
einde. Uit het experiment werd geconcludeerd dat EB3-GFP maar 1/3e van een seconde blijft
zitten en dan al weer weg diffundeerd om door een andere vervangen te worden. Een
bleekexperiment zoals dit is de manier om eiwit uitwisseling te meten in een cel. Verder is rechts een
kymograaf te zien van dit experiment.
Diffusion trap, het fenomeen van moleculen zoals EB3 die maar heel kort binden, noemen we ook
wel diffusion trap, omdat ze moleculen heel even gestopt worden in hun diffusie.
In vitro reconstructie microtubuli dynamiek, je kan
microtubuli laten groeien in een testbuis of op een
glasplaat. Om het op een glasplaat te laten groeien, begin je
met een heel stevig stukje microtubuli wat je vastzet op de
glasplaat en vervolgens voeg je tubuline en een end binding
protein toe. Dan zie je rechts in een stilstaand beeld van de
video dat EB3 (groen) zich ook hier concentreert aan het
groeiende uiteinde van een microtubulus (rood). Je ziet nu
groei aan beide kanten van microtubuli en EB3 zit dan ook
aan beide kanten. Aan de plus einde vindt groei echter een
stuk sneller plaats en hoopt zich ook meer EB3 op dan aan
het min einde. Verder zie je in de kymograaf dat een groeiende
microtubulus altijd EB3 gebonden heeft. Als die dan even krimpt, is EB3
niet aanwezig maar na rescue weer wel. Aan de hoeken van de kymograaf
kan je zien dat krimp een stuk sneller gebeurt dan groei.
Single molecule analysis, vervolgens kan je de proef met een hele lage
concentratie EB3 uitvoeren. Hiervan zie je rechts de resultaten. Deze
keer is de kymograaf over een veel kortere periode uitgevoerd,
waardoor je hem als het ware verticaal uittrekt (meer opname per
seconde). Dan zie je individuele EB3 moleculen landen langs de microtubulus of op het plus einde.
Deze kymograaf bevestigd dat individuele moleculen komen, even blijven zitten en vervolgens
weer weggaan. Met deze data is berekend dat individuele EB3 moleculen aan het pluseinde
ongeveer 1/3e seconde blijven zitten.
+TIP eiwitten, zoals EB3, wisselen dus snel uit op microtubuli plus einden.
Binding plus einde, EBs herkennen de plus einden omdat deze een andere structuur hebben: een
GTP cap. Veel andere +TIPs herkennen microtubuli einden door binding aan EBs.
EB eiwit, heeft meerdere domeinen, waaronder een globulair domein (CH domein) dat aan
microtubuli bindt. Middels een ongestructureerde gedeelte (linker) wordt deze gekoppeld aan een
dimerisatie domein. Deze bestaat uit een coiled coil waar je o.a. een hydrofoob gedeelte zit waarmee

, EBs aan hun partners kunnen binden. Aan het
einde zit ook nog een zure staart die negatief
geladen is en daar kunnen ook eiwitten aan
binden.
CH domein, het calponin homology domain van
EBs stelt deze eiwitten in staat aan microtubuli te
binden. Het bindt heel dicht bij de plek waar β-
tubuline GTP bindt. In het vorige hoorcollege
kwam al naar voor dat alleen β-GTP
gehydroliseerd kan worden en dat α-tubuline dus
altijd een GTP gebonden heeft. Als gevolg is de
binding van EBs gevoelig/afhankelijk van de
conformatie van β-tubuline. Het bindt een stuk
beter aan β-GTP dan β-GDP.
GTP analogen, bovenstaande is ontdekt aan de hand van GTP analogen
die niet gehydroliseerd kunnen worden. Bij hydrolisatie van GTP naar
GDP valt de gamma fosfaat groep weg en door de structuur van de
fosfaatgroepen net iets aan te passen is dit niet meer mogelijk (GTP𝛾S)
of verloopt het enorm sloom (GMPCPP) afhankelijk van de GTP analoog
die je gebruikt. Dit bevordert tubuline polymerisatie en remt
depolimerisatie. Rechts zie je in het geval van GTP𝛾S dat EB3 over de
gehele lengte van de microtubuli bindt.
EB eiwitten binden dus aan de GTP cap.
EB partners, er zijn ongelooflijk veel eiwitten die aan EBs binden (> 50 in
zoogdieren) en daardoor dus indirect aan het groeiende plus einde.
CLIP-170, deze eiwitfamilie kan aan EBs binden. Alle CLIP-170
eiwitten hebben een globulair CAP-Gly domein wat aan de
staart van EB eiwitten kan binden. Deze staart is
ongestructureerd en voornamelijk opgebouwd uit zuren (bv
glutamaat). De α-tubuline staart bevat ook zuren en CLIP-170
eiwitten kunnen dus zowel aan EBs als aan α-tubuline binden.
Ze hebben echter een hogere affiniteit voor EBs, waardoor
CLIP-170 eiwitten voornamelijk aan het plus einde van
microtubuli te vinden zijn en dus als +TIPs beschouwd worden.
Verder heeft CLIP-170 zelf ook een zure staart (aspartaat
residuen), waardoor die ook in staat is aan zichzelf te binden.
Microtubule plus end tracking proteins, in aanwezigheid van EBs kunnen CLIP-170 eiwitten gebruikt
worden als microtubule plus end tracking proteins. Een ander eiwit dat hiervoor ook gebruikt kan
worden is p150. Dit is een grote subunit van dynactine wat normaal een complex vormt met dyneïne
en rechts in de afbeelding is te zein dat die ook een EB bindingsdomein heeft.
+TIPs met basische/serine rijke regio’s, eiwitten met basische stukken die serine rijk zijn (rood
aangegeven) kunnen ook aan EBs binden. Dit zijn heel veel verschillende soorten eiwitten:
- APC, betrokken bij signaleringsprocessen en vaak
gemuteerd is bij kanker van de dikke darm
- MACF, is een crosslinker van actine en
microtubuli etc.
- …
Dit is dus een grote groep aan eiwitten die niet
gerelateerd zijn, maar wel EBs kunnen binden en dat
komt door de niet-gestructureerde positief regio’s die rijk
zijn aan serine en prolines. In deze regio’s is een
overeenkomend motief ontdekt: SxIP.