Experiment 1:
Succinaat dehydrogenase SDH komt voor in de mitochondria (binnenste membraan)
Succinaat is het substraat
SDH wordt bepaald door kwantitatieve reductie van kleurloos tetrazoliumzout TTC
tot rood wateronoplosbaar formazan. (omzetting waarneembaar bij 480nm)
Natrium dithioniet zorgt voor reductie van TTC tot formazan bij de SDH-assay, zodat
er een ijklijn opgesteld kan worden.
Aceton wordt toegevoegd omdat het ervoor zorgt dat de formazan-neerslag oplost
=> OD-bepaling mogelijk
Cellen in sucroseoplossing brengen, want in water zouden de cellen barsten door
osmose
Weefselfractionaties op ijs bijhouden om proteases te inhiberen
Centrifugatie: hoe hoger g, hoe kleiner de deeltjes die neerslaan
Potter-Elvejhem homogenisator: met een stamper worden de cellen gebroken m.b.v.
druk, maar de organellen blijven wel intact => dus om organellen uit de cellen te
halen
Blanco geeft de SDH-assay zonder substraat, zodat het achtergrondgeruis gemeten
kan worden.
Drooggewicht wordt bepaald voor het berekenen van het aantal gram weefsel per ml
weefselfractie, voor het berekenen van de extinctiecoëfficient, en voor het
controleren van de juistheid van de colorische methode.
Experiment 2:
Lactaat dehydrogenase (LDH) komt vooral voor in hart, lever, RBC, nier, spier, longen
en hersenen
LDH heeft 5 isoenzymes, LDH-5 zit in lever en spier
LDH 1-4 = negatief, LDH5 = positief
Iso-elektrisch punt van LDH spier: pI = 8,44 & LDH hart: pI = 5,71 (gegeven op test)
TE buffer zorgt ervoor dat DNA en RNA oplosbaar worden, zonder dat ze worden
afgebroken.
Testen van de zuiverheid wordt gedaan door eiwit- en enzym assay’s en door het
uitvoeren van SDS page, western blot en natieve elektroforetische isoenzyme-
scheiding.
Ammoniumprecipitatie dient om de eiwitten te scheiden op basis van oplosbaarheid
in stijgende AS concentratie: hoe hoger de zoutconcentratie => hoe lager de
oplosbaarheid => verklaring: het AS zout zal in competitie treden met de eiwitten
voor het binden aan de aanwezige watermoleculen om zo een watermantel te
vormen. Als de zouten reeds de watermoleculen in beslag nemen, zullen de eiwitten
geen watermantel kunnen vormen en zullen ze dus samenklitten => neerslag.
Succinaat dehydrogenase SDH komt voor in de mitochondria (binnenste membraan)
Succinaat is het substraat
SDH wordt bepaald door kwantitatieve reductie van kleurloos tetrazoliumzout TTC
tot rood wateronoplosbaar formazan. (omzetting waarneembaar bij 480nm)
Natrium dithioniet zorgt voor reductie van TTC tot formazan bij de SDH-assay, zodat
er een ijklijn opgesteld kan worden.
Aceton wordt toegevoegd omdat het ervoor zorgt dat de formazan-neerslag oplost
=> OD-bepaling mogelijk
Cellen in sucroseoplossing brengen, want in water zouden de cellen barsten door
osmose
Weefselfractionaties op ijs bijhouden om proteases te inhiberen
Centrifugatie: hoe hoger g, hoe kleiner de deeltjes die neerslaan
Potter-Elvejhem homogenisator: met een stamper worden de cellen gebroken m.b.v.
druk, maar de organellen blijven wel intact => dus om organellen uit de cellen te
halen
Blanco geeft de SDH-assay zonder substraat, zodat het achtergrondgeruis gemeten
kan worden.
Drooggewicht wordt bepaald voor het berekenen van het aantal gram weefsel per ml
weefselfractie, voor het berekenen van de extinctiecoëfficient, en voor het
controleren van de juistheid van de colorische methode.
Experiment 2:
Lactaat dehydrogenase (LDH) komt vooral voor in hart, lever, RBC, nier, spier, longen
en hersenen
LDH heeft 5 isoenzymes, LDH-5 zit in lever en spier
LDH 1-4 = negatief, LDH5 = positief
Iso-elektrisch punt van LDH spier: pI = 8,44 & LDH hart: pI = 5,71 (gegeven op test)
TE buffer zorgt ervoor dat DNA en RNA oplosbaar worden, zonder dat ze worden
afgebroken.
Testen van de zuiverheid wordt gedaan door eiwit- en enzym assay’s en door het
uitvoeren van SDS page, western blot en natieve elektroforetische isoenzyme-
scheiding.
Ammoniumprecipitatie dient om de eiwitten te scheiden op basis van oplosbaarheid
in stijgende AS concentratie: hoe hoger de zoutconcentratie => hoe lager de
oplosbaarheid => verklaring: het AS zout zal in competitie treden met de eiwitten
voor het binden aan de aanwezige watermoleculen om zo een watermantel te
vormen. Als de zouten reeds de watermoleculen in beslag nemen, zullen de eiwitten
geen watermantel kunnen vormen en zullen ze dus samenklitten => neerslag.
