Les 3: nieuwe technieken en hun
toepassingen
Sanger sequencing: low cost (al lang op de markt dus patenten vervangen), Sanger
sequencing maakt geen fouten:, super betrouwbaar.
Next generation sequencing (15 jaar geleden ongeveer): duur (700.000 euro), veel
expertise nodig, manueel read in andere richting laten lopen, makkelijker fouten (10.000
euro kwijt, want kostte zoveel aan reagentia). Ondertussen makkelijker geworden: grotere
cartridges, toestellen geëvolueerd, goedkoper.
Single cell sequencing
Single cell RNA sequencing was de 2018 breakthrough of the year. 10x genomics is een
Amerikaans biotech bedrijft dat zich toelegt op single cell sequencing. Het stelt ons in
staat om naar subcellulaire fracties te kijken.
Vroeger vertrok men vanuit een tumorbiopt. Dus stak men tissue in de blender, daaruit
ging men RNA extraheren en dat ging men gaan sequencen? Read-out is genexpressie van
bulk van cellen die aanwezig waren in tumoraal biopt (niet zuiver). Dat geeft echter een
soort van ruis op de meting. Genexpressie die je eruit krijgt is een gemiddelde van
genexpressie alle cellen,
Bij single cell analysis wordt er per cel naar de expressie gekeken. Het verschil tussen de
twee is dat bulk analysis is veel goedkoper. Voor 200 euro kan je al analyse hebben, terwijl
single cell analysus 2000 euro kost, plus het aantal cellen dat je kunt analyeren is beperkt.
Workflow van een 10x genomics
RNA extraheren in a single cell
manner
Barcoded beads worden gemengd
met cellen en regentia in een olie
emulsie (lijkt op digitale droplet PCR)
1 droplet met 1 cel met beads en
reagentia
10 000 cellen per well is de grote orde
Epje met emulsie, beads and single cells à transcriptase toedienen à pool van cellen
, De beads zijn gecoat met oligonucleotiden. Deze oligonucleotiden bestaan uit:
- truSeq read 1: maakt dat library (alle sequenties in well) compatible is met Illumina
sequencing
- Barcode: elke verschillende bead heeft een verschillende barcode à maar die is
hetzelfde voor alle oligonucleotides van 1 bead
o Laat toe om mRNA molecules terug te koppelen aan een bepaalde cel
§ Is de sleutel tot de single cell sequencing
- UMI: unique molecular identifier
o Je moet uw fragmenten PCRen om genoeg aantallen te hebben
o PCR stap houdt altijd bias in
o Als je een PCR doet, ga je uw fragmenten amplificeren, maar je wilt weten
hoeveel mRNA moleculen je hebt van bv. van huishoudgen à sommigere
fragmenten gaan makkelijker amplificeren dan andere à amplificatie kan
foutief signaal geven
o Elke oligonucleotiden heeft een verschillende UMI à je kan unbiased gaan
kijken hoeveel die aanwezig was in het staal
- Poly(dt)
o Je vangt mRNA moleculen
Je kan gebruik maken van verschillende Ilumina moddelen om uit te lezen.
toepassingen
Sanger sequencing: low cost (al lang op de markt dus patenten vervangen), Sanger
sequencing maakt geen fouten:, super betrouwbaar.
Next generation sequencing (15 jaar geleden ongeveer): duur (700.000 euro), veel
expertise nodig, manueel read in andere richting laten lopen, makkelijker fouten (10.000
euro kwijt, want kostte zoveel aan reagentia). Ondertussen makkelijker geworden: grotere
cartridges, toestellen geëvolueerd, goedkoper.
Single cell sequencing
Single cell RNA sequencing was de 2018 breakthrough of the year. 10x genomics is een
Amerikaans biotech bedrijft dat zich toelegt op single cell sequencing. Het stelt ons in
staat om naar subcellulaire fracties te kijken.
Vroeger vertrok men vanuit een tumorbiopt. Dus stak men tissue in de blender, daaruit
ging men RNA extraheren en dat ging men gaan sequencen? Read-out is genexpressie van
bulk van cellen die aanwezig waren in tumoraal biopt (niet zuiver). Dat geeft echter een
soort van ruis op de meting. Genexpressie die je eruit krijgt is een gemiddelde van
genexpressie alle cellen,
Bij single cell analysis wordt er per cel naar de expressie gekeken. Het verschil tussen de
twee is dat bulk analysis is veel goedkoper. Voor 200 euro kan je al analyse hebben, terwijl
single cell analysus 2000 euro kost, plus het aantal cellen dat je kunt analyeren is beperkt.
Workflow van een 10x genomics
RNA extraheren in a single cell
manner
Barcoded beads worden gemengd
met cellen en regentia in een olie
emulsie (lijkt op digitale droplet PCR)
1 droplet met 1 cel met beads en
reagentia
10 000 cellen per well is de grote orde
Epje met emulsie, beads and single cells à transcriptase toedienen à pool van cellen
, De beads zijn gecoat met oligonucleotiden. Deze oligonucleotiden bestaan uit:
- truSeq read 1: maakt dat library (alle sequenties in well) compatible is met Illumina
sequencing
- Barcode: elke verschillende bead heeft een verschillende barcode à maar die is
hetzelfde voor alle oligonucleotides van 1 bead
o Laat toe om mRNA molecules terug te koppelen aan een bepaalde cel
§ Is de sleutel tot de single cell sequencing
- UMI: unique molecular identifier
o Je moet uw fragmenten PCRen om genoeg aantallen te hebben
o PCR stap houdt altijd bias in
o Als je een PCR doet, ga je uw fragmenten amplificeren, maar je wilt weten
hoeveel mRNA moleculen je hebt van bv. van huishoudgen à sommigere
fragmenten gaan makkelijker amplificeren dan andere à amplificatie kan
foutief signaal geven
o Elke oligonucleotiden heeft een verschillende UMI à je kan unbiased gaan
kijken hoeveel die aanwezig was in het staal
- Poly(dt)
o Je vangt mRNA moleculen
Je kan gebruik maken van verschillende Ilumina moddelen om uit te lezen.
