Mutatiedetectie technieken
Waarvoor dient techniek en voor en na delen kennen
Oorzaken van (erfelijke) aandoening
Verstoring van het normale biologische proces (eiwit) ten gevolge van:
• abnormale hoeveelheid v.e. eiwit (te veel/te weinig)
• verandering van functie v.e. eiwit
• verstoring van het expressiepatroon v.e. eiwit
Afwijking op DNA niveau
• chromosomale afwijkingen (numeriek/structureel)
• deletie / insertie /herrangschikking
• puntmutatie
• dynamische mutatie (repeat-expansie)
Cytogenetica: chromosomen en afwijkinging hieraan
Belangrijkste onderzoeken: conventioneel chromosomenonderzoek en
FISH
Conventioneel chromosomenonderzoek/karyotypering:
opstellen karyogram grote structurele en numerieke afwijkingen
vaststellen bv Down syndroom
Stap 1: vertrekken vanuit delende cellen perifeer bloed in cultuur zetten met mitogenen om cellen aan te
zetten tot deling
Stap 2: tijdens mitose condenseren chromosomen zodat ze zichtbaar worden onder lichtmicroscoop, tijdens
metafase meest gecondenseerd dus beste fase celdeling na enkele dagen stopgezet in metafase door
colcemide
Hypotone oplossing toegevoegd zodat cellen groter worden en chromosomen meer plaats krijgen, fixatie cel
Stap 3: spreiden van cellen op objectglaasjes
Stap 4: differentiele kleuring afwijkingen worden zichtbaar (bandenpatroon verkregen, specifiek voor elk
chromosoom)
Soorten kleuringen: Q-bandering, G-bandering (meest gebruikt) of R-bandering
Stap 5: metafasen selecteren onder lichtmicroscoop, minstens 2 metafasen onderzocht bij constitutionele
indicaties, bij verworven aandoeningen minstens 20 metafasen
Stap 6: karyogram opstellen= chromosomen sorteren op grootte en volgens centromeerpositie
Kleiner dan 5Mb niet opsporen met conventioneel
chromosomenonderzoek
FISH/Fluorescente in situ hybridisatie
Fluorescent gelabelde DNA probe gehybridiseerd met metafase of
interfase chromosomen visualiseerd onder fluorescentiemicroscooop
Bij gezond persoon probe bindt aan beide chromosomen
Bij deletie probe bindt aan 1 chromosoomsegment
Extra materiaal probe bindt op 3 chromosomen
Verschillende gelabelde probes kunnen gebruikt worden tijdens zelfde
onderzoek (niet te veel, andere fluo niet meer zichtbaar)
Stap 1: denaturatie doelwit DNA en probe DNA enkelstrengig maken door verwarming of incubatie
met denaturerende reagentia
Stap 2: hybridisatie probe en doelwit gecombineerd en geincubeerd op 37° C complementaire
bindingen thv van homologe sequenties tussen probe en doelwit
Stap 3: post-hybridisatiewasstappen niet-specifiek gebonden probes worden weggewassen met
buffers
Stap 4: detectie onder fluorescentiemicroscoop
Voordeel: Minder arbeidsintensief en minder tijd dan
karyotypering, ook iets kleinere mutaties zichtbaar
Nadeel: beperkte info dus moet op voorhand vermoeden hebben
Indicaties cytogenetisch onderzoek
− Fertiliteitsproblemen: bij koppels met een voorgeschiedenis van infertiliteitof herhaalde miskramen
, − Familiale voorgeschiedenis: bij familieleden van dragers van een gebalanceerde
Chomosoomafwijking (dragerschap bepalen)
− Neoplasie: zo goed als alle kankers worden geassocieerd met chromosoomafwijkingen
− Numerieke chromosoomafwijkingen: bv Down syndroom (trisomie 21), Patau syndroom (trisomie 13), Edwards
syndroom (trisomie 18), Turner syndroom (45,X) of Kliniefelter (47,XXY)
− Trisomie karakterisatie: conventioneel chromosomenonderzoek is nodig om uit te maken of de trisomie te
wijten is aan een extra chromosoom (vrije trisomie) of een Robertsoniaanse translocatie waarbij het trisomisch
chromosoom betrokken is.
− Ouders van een kind of foetus met een chromosoomafwijking: om na te gaan of de ongebalanceerde afwijking
bij het kind het gevolg kan zijn van een gebalanceerde
chromosoomafwijking bij één van beide ouders.
− Opvolging van afwijking gedetecteerd met bv micro-array
Arraytechnologie
Moleculaire gerichte techniek
2 grote types voor opsporen Copy Number Variaties (CNV): array-CGH
(comparative genomic hybridization) en SNP (single nucleotide
polymorphism)
Array-CGH/Micro-array
DNA van patiënt en referentiepersoon worden gemerkt met verschillende
fluorescente groepen en samen op een chip gehybridiseerd. Over of
ondermaat van fluorescente groep = duplicatie of deletie van dat stuk
hoeveelheid DNA op probe wordt berekend door te vergelijken tov
referentie
SNP array
Chip die honderdduizende tot miljoenen probes bevat, verspreid over hele
genoom
Hogere concentratie van probes uit polymorfe stukken in genoom
Ten opzichte van referentieset vergelijken
+ microarray
Hoge resolutie
Geen cellen in kweek moeten brengen, rechtstreeks DNA isoleren uit
aangeleverd materiaal
Genoom wijd
— microarray
Gebalanceerde afwijken kunnen niet gedetecteerd worden bv verschil vrije
trisomie 21 of rob(21;21) =translocatie OF rob (21,14) ga je niet zien op
micro array kan belangrijk zijn voor overerving
Lage mozaieken kunnen gemist worden
+ SNP (tov CGH)
Parentale oorsprong CNV kan achterhaald worden
Triploidie kan gedetecteerd worden
Uniparentale disomie (UPD= 2 kopijen van 1 ouder en 0 van andere) kan
worden gedetecteerd als genotype ouders wordt bepaald
-- SNP
Kan enkel in polymorfe stukken
logR= intensiteit patient tov referentie (0 = gelijk, hoger= meer allelen,
lager= minder allelen)
3 probes afwijkend= geloven dat er een mutatie is
om de 100kb een probe = resolutie 200kb
om de 50kb een probe= resolutie 100kb
Waarvoor dient techniek en voor en na delen kennen
Oorzaken van (erfelijke) aandoening
Verstoring van het normale biologische proces (eiwit) ten gevolge van:
• abnormale hoeveelheid v.e. eiwit (te veel/te weinig)
• verandering van functie v.e. eiwit
• verstoring van het expressiepatroon v.e. eiwit
Afwijking op DNA niveau
• chromosomale afwijkingen (numeriek/structureel)
• deletie / insertie /herrangschikking
• puntmutatie
• dynamische mutatie (repeat-expansie)
Cytogenetica: chromosomen en afwijkinging hieraan
Belangrijkste onderzoeken: conventioneel chromosomenonderzoek en
FISH
Conventioneel chromosomenonderzoek/karyotypering:
opstellen karyogram grote structurele en numerieke afwijkingen
vaststellen bv Down syndroom
Stap 1: vertrekken vanuit delende cellen perifeer bloed in cultuur zetten met mitogenen om cellen aan te
zetten tot deling
Stap 2: tijdens mitose condenseren chromosomen zodat ze zichtbaar worden onder lichtmicroscoop, tijdens
metafase meest gecondenseerd dus beste fase celdeling na enkele dagen stopgezet in metafase door
colcemide
Hypotone oplossing toegevoegd zodat cellen groter worden en chromosomen meer plaats krijgen, fixatie cel
Stap 3: spreiden van cellen op objectglaasjes
Stap 4: differentiele kleuring afwijkingen worden zichtbaar (bandenpatroon verkregen, specifiek voor elk
chromosoom)
Soorten kleuringen: Q-bandering, G-bandering (meest gebruikt) of R-bandering
Stap 5: metafasen selecteren onder lichtmicroscoop, minstens 2 metafasen onderzocht bij constitutionele
indicaties, bij verworven aandoeningen minstens 20 metafasen
Stap 6: karyogram opstellen= chromosomen sorteren op grootte en volgens centromeerpositie
Kleiner dan 5Mb niet opsporen met conventioneel
chromosomenonderzoek
FISH/Fluorescente in situ hybridisatie
Fluorescent gelabelde DNA probe gehybridiseerd met metafase of
interfase chromosomen visualiseerd onder fluorescentiemicroscooop
Bij gezond persoon probe bindt aan beide chromosomen
Bij deletie probe bindt aan 1 chromosoomsegment
Extra materiaal probe bindt op 3 chromosomen
Verschillende gelabelde probes kunnen gebruikt worden tijdens zelfde
onderzoek (niet te veel, andere fluo niet meer zichtbaar)
Stap 1: denaturatie doelwit DNA en probe DNA enkelstrengig maken door verwarming of incubatie
met denaturerende reagentia
Stap 2: hybridisatie probe en doelwit gecombineerd en geincubeerd op 37° C complementaire
bindingen thv van homologe sequenties tussen probe en doelwit
Stap 3: post-hybridisatiewasstappen niet-specifiek gebonden probes worden weggewassen met
buffers
Stap 4: detectie onder fluorescentiemicroscoop
Voordeel: Minder arbeidsintensief en minder tijd dan
karyotypering, ook iets kleinere mutaties zichtbaar
Nadeel: beperkte info dus moet op voorhand vermoeden hebben
Indicaties cytogenetisch onderzoek
− Fertiliteitsproblemen: bij koppels met een voorgeschiedenis van infertiliteitof herhaalde miskramen
, − Familiale voorgeschiedenis: bij familieleden van dragers van een gebalanceerde
Chomosoomafwijking (dragerschap bepalen)
− Neoplasie: zo goed als alle kankers worden geassocieerd met chromosoomafwijkingen
− Numerieke chromosoomafwijkingen: bv Down syndroom (trisomie 21), Patau syndroom (trisomie 13), Edwards
syndroom (trisomie 18), Turner syndroom (45,X) of Kliniefelter (47,XXY)
− Trisomie karakterisatie: conventioneel chromosomenonderzoek is nodig om uit te maken of de trisomie te
wijten is aan een extra chromosoom (vrije trisomie) of een Robertsoniaanse translocatie waarbij het trisomisch
chromosoom betrokken is.
− Ouders van een kind of foetus met een chromosoomafwijking: om na te gaan of de ongebalanceerde afwijking
bij het kind het gevolg kan zijn van een gebalanceerde
chromosoomafwijking bij één van beide ouders.
− Opvolging van afwijking gedetecteerd met bv micro-array
Arraytechnologie
Moleculaire gerichte techniek
2 grote types voor opsporen Copy Number Variaties (CNV): array-CGH
(comparative genomic hybridization) en SNP (single nucleotide
polymorphism)
Array-CGH/Micro-array
DNA van patiënt en referentiepersoon worden gemerkt met verschillende
fluorescente groepen en samen op een chip gehybridiseerd. Over of
ondermaat van fluorescente groep = duplicatie of deletie van dat stuk
hoeveelheid DNA op probe wordt berekend door te vergelijken tov
referentie
SNP array
Chip die honderdduizende tot miljoenen probes bevat, verspreid over hele
genoom
Hogere concentratie van probes uit polymorfe stukken in genoom
Ten opzichte van referentieset vergelijken
+ microarray
Hoge resolutie
Geen cellen in kweek moeten brengen, rechtstreeks DNA isoleren uit
aangeleverd materiaal
Genoom wijd
— microarray
Gebalanceerde afwijken kunnen niet gedetecteerd worden bv verschil vrije
trisomie 21 of rob(21;21) =translocatie OF rob (21,14) ga je niet zien op
micro array kan belangrijk zijn voor overerving
Lage mozaieken kunnen gemist worden
+ SNP (tov CGH)
Parentale oorsprong CNV kan achterhaald worden
Triploidie kan gedetecteerd worden
Uniparentale disomie (UPD= 2 kopijen van 1 ouder en 0 van andere) kan
worden gedetecteerd als genotype ouders wordt bepaald
-- SNP
Kan enkel in polymorfe stukken
logR= intensiteit patient tov referentie (0 = gelijk, hoger= meer allelen,
lager= minder allelen)
3 probes afwijkend= geloven dat er een mutatie is
om de 100kb een probe = resolutie 200kb
om de 50kb een probe= resolutie 100kb
