Genetica & modelorganismen
Modelorganismen
- Makkelijk
- Snelle groei
- Efficiente genetica toepassen
- Makkelijk mutanten vinden in screens
- Dubbelmutanten maken
- Manipulatie van het genoom
- Homologe recombinatie
- Expressie van plasmiden
Veelgebruikt:
- Prokaryoten
- Bacteriën (E.coli) en bacteriofagen (Lambda)
- Eukaryoten
- Schimmels (Aspergillus) en gisten (eencellig) (in het practicum)
- Planten (Arabidopsis thaliana)
- Dieren:
- Caenorabditis elegans (nematode) (in het practicum)
- Drosophila melanogaster (fruitvlieg) (college)
- Daniorerio (zebravis)
- Mus musculus (muis) (deel 4)
- Homo sapiens (mens) (deel 4)
Gist
- Eencellig
- Genetisch zeer goed te bestuderen
- Basale levensprocessen zijn vergelijkbaar met die van ons:
- Celdeling (o.a. DNA-replicatie, chromosoom scheiding)
- Metabolisme
- Eiwitlokalisatie en transport
- Meest gebruikt:
- Budding yeast (bakkersgist)
- Deelt via budding
- Rond
- Fission yeast
- Splits in tween
- Lange staaf
- Celdeling lijkt anders maar komt best overeen
- Redelijk overeenkomsten van eiwitten met mens
- Voordelen:
- Selectie mogelijk (op antibiotica)
- Transformeerbaar met plasmiden
- Genotypes kruisen
Plasmiden
- Cirkel vormig
- Gereguleerde promotor
- Galactose staat aan in aanwezigheid van galactose
- Selectie markers
- Mutant in marker aanbrengen —> gist kan niet groeien op dat medium
,Homologe recombinatie
- zeer efficient in gist
- Korte homologie sequentie is voldoende om in te bouwen
- Je kan primers bestellen met stukje extra homologie
- Knock out maken:
- Zit selectie marker in om te kijken of het gelukt is
- Unique barcode: terugvinden in sequencing
Combineren van genotypes
- Diploïde maken door conjugatie
- Gist kruisen met opposite mating type
Haploide - diploïde levenscyclus Budding yeast
- Als gist hem stress gaat hij haploide sporen vormen
- Twee samen kunnen conjugeren
- Mating type switchen, alpha kan a worden en andersom
- Homothalic yeast
- Regulatie net wat anders dan anderen
- HMR en HML wordt niet afgeschreven, wordt geremd
- Ho endonuclease knipt gen eruit en zet in het midden
- Na knippen volgt meestal een mating switch
- Het midden bepaald de mating type
- Is biased naar 1 switch
- Willen we niet in het lab: mutant van HO gen gebruiken
- Sporulatie wordt wel geïnduceerd: nutrient arm medium
Fission yeast
- Soortgelijke levenscyclus
- Haploid en diploid en kan sporen vormen
Genetische screen
Opzet:
- Proces waarin je geïnteresseerd bent: welke genen zijn hierbij betrokken?
- Mutant of DNA schade
- Wat heb je beschadigd?
, Genen betrokken bij celcyclus?
- Temperatuur gevoelige mutanten maken: niet functioneel bij (vaak) een hoge temperatuur
- Blijft hangen in metafase
Eiwitten gevonden in screens:
- CDC28 budding yeast/Cdc2 fission yeast
- Stimuleert celdeling
- Nu CDK1
- Celcyclus, snelheids bepalend
- Te weinig: geen celdeling
- Te veel: te snelle celdeling, te kleine gistcellen
- Wee
- Bindt aan cyclinen, reguleert cyclines
- Humane CDK1 kan gist CDK1 vervangen
- Wee1 deletie mutanten—> delen te snel
- Remt normaal celdeling
- CDC25 deletie mutanten —> stoppen celdeling (in mitose)
- Stimuleert celdeling
- Werken ze individueel of in een lineaire pathway?
——> genetische epistase analyse
Genetische epistase analyse
- Dubbel mutant maken van twee verschillende fenotypen
- Combineren —> welk fenotype?
- Cdc28-: mutant stopt celdeling
- Wee1-: mutant deelt te snel
- Observatie: dubbel mutant heeft het cdc28- fenotype: 2 valt af
- Wee1: negatieve fosforylering
- Cdc25: activerende fosfatase
Modelorganismen
- Makkelijk
- Snelle groei
- Efficiente genetica toepassen
- Makkelijk mutanten vinden in screens
- Dubbelmutanten maken
- Manipulatie van het genoom
- Homologe recombinatie
- Expressie van plasmiden
Veelgebruikt:
- Prokaryoten
- Bacteriën (E.coli) en bacteriofagen (Lambda)
- Eukaryoten
- Schimmels (Aspergillus) en gisten (eencellig) (in het practicum)
- Planten (Arabidopsis thaliana)
- Dieren:
- Caenorabditis elegans (nematode) (in het practicum)
- Drosophila melanogaster (fruitvlieg) (college)
- Daniorerio (zebravis)
- Mus musculus (muis) (deel 4)
- Homo sapiens (mens) (deel 4)
Gist
- Eencellig
- Genetisch zeer goed te bestuderen
- Basale levensprocessen zijn vergelijkbaar met die van ons:
- Celdeling (o.a. DNA-replicatie, chromosoom scheiding)
- Metabolisme
- Eiwitlokalisatie en transport
- Meest gebruikt:
- Budding yeast (bakkersgist)
- Deelt via budding
- Rond
- Fission yeast
- Splits in tween
- Lange staaf
- Celdeling lijkt anders maar komt best overeen
- Redelijk overeenkomsten van eiwitten met mens
- Voordelen:
- Selectie mogelijk (op antibiotica)
- Transformeerbaar met plasmiden
- Genotypes kruisen
Plasmiden
- Cirkel vormig
- Gereguleerde promotor
- Galactose staat aan in aanwezigheid van galactose
- Selectie markers
- Mutant in marker aanbrengen —> gist kan niet groeien op dat medium
,Homologe recombinatie
- zeer efficient in gist
- Korte homologie sequentie is voldoende om in te bouwen
- Je kan primers bestellen met stukje extra homologie
- Knock out maken:
- Zit selectie marker in om te kijken of het gelukt is
- Unique barcode: terugvinden in sequencing
Combineren van genotypes
- Diploïde maken door conjugatie
- Gist kruisen met opposite mating type
Haploide - diploïde levenscyclus Budding yeast
- Als gist hem stress gaat hij haploide sporen vormen
- Twee samen kunnen conjugeren
- Mating type switchen, alpha kan a worden en andersom
- Homothalic yeast
- Regulatie net wat anders dan anderen
- HMR en HML wordt niet afgeschreven, wordt geremd
- Ho endonuclease knipt gen eruit en zet in het midden
- Na knippen volgt meestal een mating switch
- Het midden bepaald de mating type
- Is biased naar 1 switch
- Willen we niet in het lab: mutant van HO gen gebruiken
- Sporulatie wordt wel geïnduceerd: nutrient arm medium
Fission yeast
- Soortgelijke levenscyclus
- Haploid en diploid en kan sporen vormen
Genetische screen
Opzet:
- Proces waarin je geïnteresseerd bent: welke genen zijn hierbij betrokken?
- Mutant of DNA schade
- Wat heb je beschadigd?
, Genen betrokken bij celcyclus?
- Temperatuur gevoelige mutanten maken: niet functioneel bij (vaak) een hoge temperatuur
- Blijft hangen in metafase
Eiwitten gevonden in screens:
- CDC28 budding yeast/Cdc2 fission yeast
- Stimuleert celdeling
- Nu CDK1
- Celcyclus, snelheids bepalend
- Te weinig: geen celdeling
- Te veel: te snelle celdeling, te kleine gistcellen
- Wee
- Bindt aan cyclinen, reguleert cyclines
- Humane CDK1 kan gist CDK1 vervangen
- Wee1 deletie mutanten—> delen te snel
- Remt normaal celdeling
- CDC25 deletie mutanten —> stoppen celdeling (in mitose)
- Stimuleert celdeling
- Werken ze individueel of in een lineaire pathway?
——> genetische epistase analyse
Genetische epistase analyse
- Dubbel mutant maken van twee verschillende fenotypen
- Combineren —> welk fenotype?
- Cdc28-: mutant stopt celdeling
- Wee1-: mutant deelt te snel
- Observatie: dubbel mutant heeft het cdc28- fenotype: 2 valt af
- Wee1: negatieve fosforylering
- Cdc25: activerende fosfatase
