MBT samenvatting

MBT
Hoorcollege 2 PCR
De PCR vermenigvuldigt (amplificeert) een specifiek stuk DNA.
De PCR wordt gebruikt voor:

• Controle van gen aanwezigheid
• Kloneren
• Onderzoek naar functie van genen of werking promoters
• Identificatie van micro-organismen
• Forensisch onderzoek

De standaard stappen voor een PCR:
PCR → Gelelektroforese → uv-lichtbehandeling → resultaat

De PCR-techniek is gebaseerd op DNA-replicatie. Normaal gebeurt dit in de cel, bij de PCR gebeurt
het in vivo. DNA-polymerase beweegt over het DNA van 3’naar 5’. Op de andere streng synthetiseert
het enzym tegelijkertijd van 5’ naar 3’.




De primers maken de PCR specifiek. De cel gebruikt RNA primers. Bij de PCR worden DNA primers
gebruikt (oligo’s). De meest gebruikte polymerase is Taq polymerase. Polymerase hebben een primer
nodig om te beginnen met een open 3’ einde. Taq polymerase werkt optimaal bij 72°C. Het enzym
denatureert niet bij de denaturatietemperatuur van 96°C.

Benodigdheden PCR:

• PCR machine
• PCR reactievaatjes
• PCR reactiemengsel
o DNA template
o Twee primers
o Nucleotiden
o Taq polymerase
o PCR buffer
• Analyse systeem

,De drie stappen van de PCR:

1. Denaturatie (losmaken van de twee DNA strengen (dsDNA → ssDNA))
2. Annealing (hybridisatie primers) 1 cyclys
3. Extensie (elongatie door polymerase)




Stap Tijd Temperatuur
0 Denatureren DNA (zekerheid dat het 90 – 96C 5-10 minuten
ssDNA wordt)
1 Denatureren DNA 90 – 96C 15s-30s
2 Annealen primers 50 -- 65C 15s-30s
3 Extensie 72C 30s-5minuten (afhankelijk van de
fragmentlengte)
4 DNA-synthese (zekerheid dat alles 72C 10 minuten
volledig synthetiseert)


Primers
❖ Korte stukjes enkelstrengs DNA (18-25 nucleotiden).
❖ Oligo’s
❖ Synthetisch te maken
❖ Specifiek




Forward primer Reverse primer

, De kans dat een primer willekeurig in het DNA kan binden kan je uitrekenen door de primerlengte als
macht boven ¼ te zetten → ¼ n.
Als een sequentie wordt gegeven zonder richting dan lees je hem altijd van 5’ naar 3’ (van links naar
rechts).
Er zijn twee soorten primers:

− Forward primer (dezelfde sequentie als het template DNA)
− Reverse primer (reverse complementair als het template DNA)

Bij primerdesign zijn er bepaalde regels waar rekening mee moet worden gehouden:

− 3’-einde bevat een G of C, dit voor stabiliteit van de primer
− 17-28 basenparen lang
− 40-60% GC
− Voorkomen van primer dimeren
− Voorkom self annealing
− Tm Tussen de 55°C en 70°C.
− Verschil in Tm tussen de primers max. 2°C.
− Zorg voor specificiteit (door blasten kan je dit controleren)

De Tm = wanneer 50% van de primers nog binden aan de target sequentie.
Fluore




Berekening voor T deTemperat
Tm=2(A+T) + 4(C+G)
Dit is een grove schatting waar veel factoren (thermodynamica en sequentieherhalingen) weg
worden gelaten.
Je wilt dat alle primers gebonden zijn dus: Ta = Tm - 5°C.
Voor de PCR heb je twee primers nodig, De laagste Ta die je hebt uitgerekend gebruik je voor de
annealtemperatuur. Bij een te lage temperatuur zullen er aspecifieke PCR-producten ontstaan. Bij
een te hoge temperatuur plakken de primers niet goed.

, Polymerase
Het meest gebruikte polymerase is Taq polymerase. Die werkt optimaal bij 72°C. Het enzym is
hittestabiel, maar Taq polymerase heeft geen proofreading. Proofreading is een systeem waarbij fout
ingebouwde basen worden herkend en via een 3’→5’ exonuclease activiteit enzymatisch worden
verwijderd. Dit systeem gaat ten kostte van de snelheid. Er geldt: hoe specifieker/preciezer het
enzym hoe trager het enzym werkt.

Bronnen template DNA
Voorwaarden voor DNA:

− Meestal wordt het gezuiverd
− Geen remmers
− Target bereikbaar voor de primers en Taq polymerase (geen loops of andere structuren)
− Geen EDTA (of hele lage concentratie): Mg2+
− Niet teveel fragemtatie (afbraak)
− Niet te vaak invriezen en ontdooien

Factoren die bijdragen aan degradatie:

− Tijd
− Temperatuur
− Vochtigheid
− Licht (UV)
− Chemicaliën

Overige ingrediënten PCR reactie:
− Nucleotiden (dNTP’s waarbij de “d” voor deoxy staat).
Ze binden ook met Mg2+
Te hoge concentratie → foute inbouw en mutaties
Te lage concentratie → lage synthese snelheid, maar wel specifiek
− PCR reactie buffer
De buffer zorgt voor optimale condities voor de polymerase (pH en zoutconcentratie).
− Additieven
o DMSO: reduceert secundaire structuur bij GC-rijk gebied in het DNA.
o Eiwit achtige stof, stabiliseert Taq polymerase
o Niet ionische detergentia: reduceert secundaire structuur GC-rijk gebied DNA en
stabiliseert Taq polymerase
− Reactiemix MgCl2
Co-factor van Taq DNA polymerase.
De concentratie is afhankelijk van:
o Hoeveelheid/grootte template
o Hoeveelheid primer
o Concentratie dNTP
o Nucleotide sequentie

Te lage concentrate: onvoldoende co-factor.
Te hoge concentratie: Tm stijgt, specificiteit annealing daalt, afname enzymactiviteit.