H1: Detectiemethoden
1.1 ISO-methoden en klassieke cultuurmethoden
ISO-methoden en het principe van de klassieke cultuurmethode kunnen uitleggen
ISO-methoden
= erkend als referentie methoden voor officiële controles
= meestal gebaseerd op de klassieke cultuurmethode
Klassieke cultuurmethode
= berust op het vermogen van het MO om zich onder geschikte omstandigheden te
vermenigvuldigen tot aantallen die waarneming mogelijk maken
= bestaat uit 4 stappen
1. Vooraanrijking: herstel van het MO; op niet- of half-selectief medium
2. Aanrijking: groei tot voldoende hoog aantal; op selectief medium
3. Isolatie/detectie: detectie van het MO; op een selectief differentiërend medium
4. Bevestiging: morfologisch, biochemisch, fysiologisch, serologisch
Kits ter bevestiging bv API
Omvat alle 4 de stappen in 1 kit. Kan gebruikt worden ter bevestiging.
Ook alternatieve methodes, bv qPCR/chromogene VB/.. kunnen gebruikt worden voor stap 4
1.2 Alternatieve (snelle) methoden
De ≠ alternatieve methoden kennen + principes kunnen uitleggen
= bij stap 3 wordt geen gebruik gemaakt van een selectief differentiërend medium
= kunnen ook gebruikt worden als methoden voor bevestiging (stap 4)
= sneller = kortere tijd, maar ook meer stalen tegelijk
Chromogene VB
= er wordt gewerkt met een chromogeen substraat ipv
met een pH indicator
= bevestigende testen mogen, maar kunnen
geëlimineerd worden
1
,Immunologische methoden
= principe: interactie antilichaam (specifiek AL gebruiken) en antigen (deeltje van MO)
ELISA (VIDASⓇ)
= Antigeen zit gesandwicht tussen 2 antilichamen:
Aan de ene kant: antilichaam gebonden specifiek voor de bacterie waarnaar je op zoek bent
Aan de andere kant: antilichaam gebonden aan enzym. In de laatste stap wordt een
substraat toegevoegd. Dit substraat wordt omgezet door het enzym waardoor er een
detecteerbaar signaal ontstaat. Het verkregen signaal is een maat voor de hoeveelheid
antigen (en dus MO) aanwezig in het staal.
Agglutinatie test (Staphytect plus)
= toepassing als stap 4 (bevestigende test)
= zichtbare agglutinatie tgv cross-linking tussen de antigenen en de gebonden antilichamen
Serotypering
= eens MO bevestigd is, kan eventueel de soort serotyperen
= bepalen van de antigenische kenmerken van het MO → serotype bepalen
Moleculaire methoden
= principe: detectie mogelijk maken door gebruik te maken van het genetisch materiaal MO
= PCR = polymerase chain reaction
Conventionele PCR
1) DNA wordt gedenatureerd: verkrijgen van 2 strengen door verhitting
2) Annealingsfase: T w verlaagd, primer w toegevoegd die past op het begin van stukje
DNA, andere primer wordt toegevoegd die past op het einde van de andere streng
3) Extensiefase of elongatiefase: T w verhoogd, enzym DNA polymerase en nucleotiden
treden in actie. Complementaie streng wordt geproduceerd met opnieuw een
dubbelstrengig DNA als resultaat = amplicon
Bovenstaande 3 stappen = exponentiële verhoging van het aantal kopieën
Vervolgens visualisatie door agarose gel elektroforese en kleuring (DNA wordt gekleurd)
Voordeel methode: geautomatiseerd, weinig arbeidsintensief en vooral snel!
qPCR = realtime PCR = kwantitatieve PCR
= variant op conventionele PCR
2
, = extra materiaal, zijnde een specifiek probe → kan binden op DNA→ fluorescent signaal →
vorming PCR-product wordt tijdens de PCR-reactie gedetecteerd.
Voordelen: PCR-product kan tijdens PCR-reactie gedetecteerd w + kwantificatie mogelijk:
hoe meer pathogeen aanwezig, hoe sneller threshold bereikt wordt, hoe minder cycli nodig,
hoe lager de Cq waarde. Dus: hoe lager Cq, hoe meer pathogeen aanwezig = kwantificatie
Massa spectrometrie (MS)
MALDI-TOF
= kan gebruikt worden als bevestigende test; je start vanaf een geïsoleerde kolonie
= principe: obv het EW-profiel van het MO krijg je een specifieke massa spectrum (“een
spectrale handtekening”). Deze handtekening wordt vergeleken met database.
Voordeel: zeer snel! Duurt maar 10min. Zeer interessante voordelen, maar wel zeer duur!
1.3 Vergelijking klassieke cultuurmethoden en alternatieve methoden
De voordelen en nadelen van de klassieke cultuurmethode en alternatieve methoden
kennen en kunnen verklaren
De verschillende technieken kunnen herkennen en een bepaalde techniek kunnen
toepassen op een bepaalde case. Een keuze voor een bepaalde techniek kunnen
verantwoorden.
3
1.1 ISO-methoden en klassieke cultuurmethoden
ISO-methoden en het principe van de klassieke cultuurmethode kunnen uitleggen
ISO-methoden
= erkend als referentie methoden voor officiële controles
= meestal gebaseerd op de klassieke cultuurmethode
Klassieke cultuurmethode
= berust op het vermogen van het MO om zich onder geschikte omstandigheden te
vermenigvuldigen tot aantallen die waarneming mogelijk maken
= bestaat uit 4 stappen
1. Vooraanrijking: herstel van het MO; op niet- of half-selectief medium
2. Aanrijking: groei tot voldoende hoog aantal; op selectief medium
3. Isolatie/detectie: detectie van het MO; op een selectief differentiërend medium
4. Bevestiging: morfologisch, biochemisch, fysiologisch, serologisch
Kits ter bevestiging bv API
Omvat alle 4 de stappen in 1 kit. Kan gebruikt worden ter bevestiging.
Ook alternatieve methodes, bv qPCR/chromogene VB/.. kunnen gebruikt worden voor stap 4
1.2 Alternatieve (snelle) methoden
De ≠ alternatieve methoden kennen + principes kunnen uitleggen
= bij stap 3 wordt geen gebruik gemaakt van een selectief differentiërend medium
= kunnen ook gebruikt worden als methoden voor bevestiging (stap 4)
= sneller = kortere tijd, maar ook meer stalen tegelijk
Chromogene VB
= er wordt gewerkt met een chromogeen substraat ipv
met een pH indicator
= bevestigende testen mogen, maar kunnen
geëlimineerd worden
1
,Immunologische methoden
= principe: interactie antilichaam (specifiek AL gebruiken) en antigen (deeltje van MO)
ELISA (VIDASⓇ)
= Antigeen zit gesandwicht tussen 2 antilichamen:
Aan de ene kant: antilichaam gebonden specifiek voor de bacterie waarnaar je op zoek bent
Aan de andere kant: antilichaam gebonden aan enzym. In de laatste stap wordt een
substraat toegevoegd. Dit substraat wordt omgezet door het enzym waardoor er een
detecteerbaar signaal ontstaat. Het verkregen signaal is een maat voor de hoeveelheid
antigen (en dus MO) aanwezig in het staal.
Agglutinatie test (Staphytect plus)
= toepassing als stap 4 (bevestigende test)
= zichtbare agglutinatie tgv cross-linking tussen de antigenen en de gebonden antilichamen
Serotypering
= eens MO bevestigd is, kan eventueel de soort serotyperen
= bepalen van de antigenische kenmerken van het MO → serotype bepalen
Moleculaire methoden
= principe: detectie mogelijk maken door gebruik te maken van het genetisch materiaal MO
= PCR = polymerase chain reaction
Conventionele PCR
1) DNA wordt gedenatureerd: verkrijgen van 2 strengen door verhitting
2) Annealingsfase: T w verlaagd, primer w toegevoegd die past op het begin van stukje
DNA, andere primer wordt toegevoegd die past op het einde van de andere streng
3) Extensiefase of elongatiefase: T w verhoogd, enzym DNA polymerase en nucleotiden
treden in actie. Complementaie streng wordt geproduceerd met opnieuw een
dubbelstrengig DNA als resultaat = amplicon
Bovenstaande 3 stappen = exponentiële verhoging van het aantal kopieën
Vervolgens visualisatie door agarose gel elektroforese en kleuring (DNA wordt gekleurd)
Voordeel methode: geautomatiseerd, weinig arbeidsintensief en vooral snel!
qPCR = realtime PCR = kwantitatieve PCR
= variant op conventionele PCR
2
, = extra materiaal, zijnde een specifiek probe → kan binden op DNA→ fluorescent signaal →
vorming PCR-product wordt tijdens de PCR-reactie gedetecteerd.
Voordelen: PCR-product kan tijdens PCR-reactie gedetecteerd w + kwantificatie mogelijk:
hoe meer pathogeen aanwezig, hoe sneller threshold bereikt wordt, hoe minder cycli nodig,
hoe lager de Cq waarde. Dus: hoe lager Cq, hoe meer pathogeen aanwezig = kwantificatie
Massa spectrometrie (MS)
MALDI-TOF
= kan gebruikt worden als bevestigende test; je start vanaf een geïsoleerde kolonie
= principe: obv het EW-profiel van het MO krijg je een specifieke massa spectrum (“een
spectrale handtekening”). Deze handtekening wordt vergeleken met database.
Voordeel: zeer snel! Duurt maar 10min. Zeer interessante voordelen, maar wel zeer duur!
1.3 Vergelijking klassieke cultuurmethoden en alternatieve methoden
De voordelen en nadelen van de klassieke cultuurmethode en alternatieve methoden
kennen en kunnen verklaren
De verschillende technieken kunnen herkennen en een bepaalde techniek kunnen
toepassen op een bepaalde case. Een keuze voor een bepaalde techniek kunnen
verantwoorden.
3
