Analyse van DNA en genomics (2)
Methoden 3
DNA sequentiebepaling
First-generation sequencing Second-generation sequencing Third-generation sequencing
= Sanger sequencing = next generation sequencing = next-next generation sequencing
- Cloneren mbv plasmiden en - Massief parallel sequencen - Sequencing van individuele DNA
bacteriën van clonaal in vitro moleculen zonder amplificatie
- Analyse via elektroforese geamplificeerde DNA - Bv. Nanopore, Pacific Biosciences
- Gouden standaard voor moleculen - Lage kost en uren
kleine projecten - Bv. illumina, Ion Torrent
- Hoge kost, 10 jaar - 2 weken
Toepassingen:
1. De novo genoom sequentiebepaling
= sequenties van ongekende genomen sequencen
└ Bv. Humaan Genoom project
└ Nieuwe organismen
└ Gedeeltelijk of volledig
2. Resequencing
= sequenties van individuen sequencen tov referentiegenoom
└ Verschillen tussen individuen (SNPs)
└ Mutaties (ziekten)
└ Construct verificatie
└ Klinische toepassingen: diagnose, farmacogenetica, NIPT
→ Niet invasieve prenatale test: chromosomale afwijkingen detecteren door circulerend
DNA van de placenta te sequencen
3. Sequentiebepaling als teller
= aantallen DNA (of RNA) moleculen achterhalen
De novo sequencing vs resequencing:
De novo sequencing Resequencing
1) Genoom random in kleine fragmentjes 1) Genoom van individu in kleine fragmentjes
breken breken
2) Stukjes sequencen 2) Computer mapt deze op referentiegenoom
3) Computer probeert ze aan elkaar te hangen
Referentiegenoom
- WGS = whole-genome sequencing
- WES = whole-exome sequencing
└ Exome = coderende sequentie (1,5% van genoom)
- Targeted sequencing = specifieke gewenste regio’s sequencen
- Transcriptoom = RNA omzetten naar cDNA
,1ste generatie sequentiebepaling
2 methoden:
1. Maxam en Gilbert = chemische klieving methode
2. Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
SANGER SEQUENCING
Werking:
1) Template/matrijs = gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt door cloneren of een specifiek
fragment dat geamplificeerd wordt met PCR
2) Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs toevoegen
└ ddNTP: 3’ OH groep ontbreekt → vormt normaal fosfodiesterverbindingen in DNA keten
└ Elke ddNTP heeft een fluorescent label
└ Verhouding: veel dNTPs en weinig ddNTPs (bv. 1/100)
└ Reactie loopt door na inbouwen dNTP
└ Reactie stopt na inbouwen ddNTP
3) Fragmenten met lengtes gescheiden via capillaire gelelektroforese
└ Kleine fragmentjes: eerst voorbij sensor eerst afgelezen
└ Langste fragmentjes: laatst voorbij sensor laatst afgelezen
Eletroferogram
- Beperkt tot ± 500 nt, moeite met herhalingen
- Voor betrouwbaarheid: 2 aparte reacties om beide richtingen af te lezen (FW en RV primer)
Eletroferogram aflezen:
- Kleur zegt welke nucleotide het is
- 1ste 30 bp niet afleesbaar
- Meestal 500- 700 bp goede sequentie afleesbaar
, - Software om af te lezen met kwaliteitsscores per base = Prhed-score (Q)
└ Q = -10*log10(P), met P = probabiliteit van foutieve base call
→ Foutieve base call: de foutieve base aan een piek geven
→ Bv. Q = 10: de probabiliteit om een foutieve base af te lezen is een kans van 1/10
accuraatheid = 90%
→ We willen een Q van min. 20
→ Zowel base call als kwaliteitsscore van die call zitten verwerkt in een FASTQ file
- Mutatiedetectie
└ Niet altijd even hoge pieken
└ Forward & reverse reacties bevestigen of het gaat om een sequentie-fout of een mutatie
VERWEZELIJKINGEN MET 1ST GENERATION SEQUENCING
Human Genome Project (HGP):
= grootste multinationale biologische project ooit
- 3 biljoen USD
- Gestart in 1990
- Stalen: mix van meerdere anonieme individuen
- Methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methoden
1) Genoom knippen
2) Stukken cloneren in YACs, BACs, P1s en cosmiden
3) Mappen en fragmenteren (5 jaar)
4) Sample bereiding en sequentiebepaling door 20 centers over hele wereld
5) Elke 24u publieke vrijgave sequenties
└ 2001: draft sequentie
└ 2003: finale sequentie
Referentiesequentie van de mens in databanken
- Nog steeds updates
- 1ste individuele humane genoom: J. Craig Venter
Enorme impact op:
- Technologische ontwikkelingen van sequencing
└ Automatisering: gedaalde kosten/base, enorme toename in sequentiedata
└ Aanpak: bv. sommige delen van chromosoom zoals centromeren bijna onmogelijk te cloneren
- Grote ontwikkeling van bioinformatica (softwares)
- Visie op delen van data
└ Open science = bevindingen openbaar delen voor publiek en wetenschappers
- Andere methoden omdat nu de (bijna) volledige sequentie beschikbaar is
- Biologische kennis
└ Sequentie en organisatie van bijna alle humane genen gekend
└ Vergelijkende genomics: inzicht in evolutie en in geconserveerde processen
└ Genetische verschillen tussen mensen
, Nieuwe uitdagingen:
- Volledige sequentie: telomeer tot telomeer
- Meer genomen sequencen van meerdere species
- Meer individuele humane sequenties
- Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
Enorme mogelijkheden voor ‘personalized precision medicine’:
- Kennis van DNA volgorde en SNPs diagnose, prognose & preventie
- Farmacogenomics: verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen goed/slecht reageren op
geneesmiddelen enorme impact op industrie
- Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen
- Therapie op maat (bv. kanker)
- Maar ook etische aspecten (werkgevers, verzekeringsmaatschappijen, …)
Probleem:
- Troughput en kosten
- Dus: verbeterde/ andere technologie nodig met hoge capaciteit en lage kosten
2de generatie sequentiebepaling
= short-read next generation sequencing
- Doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost
- Richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag
- 3 pijlers
1. Parallelle detectie
└ Cluster/polony maken = kopieën van een DNA template
└ Klonale in vitro amplificatie van template duizenden tot miljoenen kopieën van
DNA template per cluster
└ Multiplexing: vele cluster tegelijk
2. Miniaturisatie van reacties
3. Integratie van het proces
└ Alles geïntegreerd in 1 proces = pipline
└ Directe detectie mogelijk
- Gebaseerd op 4 stappen
1) Aanmaak DNA library
2) Klonale in vitro amplificatie
3) Sequentiebepaling
4) Data analyse
Methoden 3
DNA sequentiebepaling
First-generation sequencing Second-generation sequencing Third-generation sequencing
= Sanger sequencing = next generation sequencing = next-next generation sequencing
- Cloneren mbv plasmiden en - Massief parallel sequencen - Sequencing van individuele DNA
bacteriën van clonaal in vitro moleculen zonder amplificatie
- Analyse via elektroforese geamplificeerde DNA - Bv. Nanopore, Pacific Biosciences
- Gouden standaard voor moleculen - Lage kost en uren
kleine projecten - Bv. illumina, Ion Torrent
- Hoge kost, 10 jaar - 2 weken
Toepassingen:
1. De novo genoom sequentiebepaling
= sequenties van ongekende genomen sequencen
└ Bv. Humaan Genoom project
└ Nieuwe organismen
└ Gedeeltelijk of volledig
2. Resequencing
= sequenties van individuen sequencen tov referentiegenoom
└ Verschillen tussen individuen (SNPs)
└ Mutaties (ziekten)
└ Construct verificatie
└ Klinische toepassingen: diagnose, farmacogenetica, NIPT
→ Niet invasieve prenatale test: chromosomale afwijkingen detecteren door circulerend
DNA van de placenta te sequencen
3. Sequentiebepaling als teller
= aantallen DNA (of RNA) moleculen achterhalen
De novo sequencing vs resequencing:
De novo sequencing Resequencing
1) Genoom random in kleine fragmentjes 1) Genoom van individu in kleine fragmentjes
breken breken
2) Stukjes sequencen 2) Computer mapt deze op referentiegenoom
3) Computer probeert ze aan elkaar te hangen
Referentiegenoom
- WGS = whole-genome sequencing
- WES = whole-exome sequencing
└ Exome = coderende sequentie (1,5% van genoom)
- Targeted sequencing = specifieke gewenste regio’s sequencen
- Transcriptoom = RNA omzetten naar cDNA
,1ste generatie sequentiebepaling
2 methoden:
1. Maxam en Gilbert = chemische klieving methode
2. Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
SANGER SEQUENCING
Werking:
1) Template/matrijs = gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt door cloneren of een specifiek
fragment dat geamplificeerd wordt met PCR
2) Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs toevoegen
└ ddNTP: 3’ OH groep ontbreekt → vormt normaal fosfodiesterverbindingen in DNA keten
└ Elke ddNTP heeft een fluorescent label
└ Verhouding: veel dNTPs en weinig ddNTPs (bv. 1/100)
└ Reactie loopt door na inbouwen dNTP
└ Reactie stopt na inbouwen ddNTP
3) Fragmenten met lengtes gescheiden via capillaire gelelektroforese
└ Kleine fragmentjes: eerst voorbij sensor eerst afgelezen
└ Langste fragmentjes: laatst voorbij sensor laatst afgelezen
Eletroferogram
- Beperkt tot ± 500 nt, moeite met herhalingen
- Voor betrouwbaarheid: 2 aparte reacties om beide richtingen af te lezen (FW en RV primer)
Eletroferogram aflezen:
- Kleur zegt welke nucleotide het is
- 1ste 30 bp niet afleesbaar
- Meestal 500- 700 bp goede sequentie afleesbaar
, - Software om af te lezen met kwaliteitsscores per base = Prhed-score (Q)
└ Q = -10*log10(P), met P = probabiliteit van foutieve base call
→ Foutieve base call: de foutieve base aan een piek geven
→ Bv. Q = 10: de probabiliteit om een foutieve base af te lezen is een kans van 1/10
accuraatheid = 90%
→ We willen een Q van min. 20
→ Zowel base call als kwaliteitsscore van die call zitten verwerkt in een FASTQ file
- Mutatiedetectie
└ Niet altijd even hoge pieken
└ Forward & reverse reacties bevestigen of het gaat om een sequentie-fout of een mutatie
VERWEZELIJKINGEN MET 1ST GENERATION SEQUENCING
Human Genome Project (HGP):
= grootste multinationale biologische project ooit
- 3 biljoen USD
- Gestart in 1990
- Stalen: mix van meerdere anonieme individuen
- Methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methoden
1) Genoom knippen
2) Stukken cloneren in YACs, BACs, P1s en cosmiden
3) Mappen en fragmenteren (5 jaar)
4) Sample bereiding en sequentiebepaling door 20 centers over hele wereld
5) Elke 24u publieke vrijgave sequenties
└ 2001: draft sequentie
└ 2003: finale sequentie
Referentiesequentie van de mens in databanken
- Nog steeds updates
- 1ste individuele humane genoom: J. Craig Venter
Enorme impact op:
- Technologische ontwikkelingen van sequencing
└ Automatisering: gedaalde kosten/base, enorme toename in sequentiedata
└ Aanpak: bv. sommige delen van chromosoom zoals centromeren bijna onmogelijk te cloneren
- Grote ontwikkeling van bioinformatica (softwares)
- Visie op delen van data
└ Open science = bevindingen openbaar delen voor publiek en wetenschappers
- Andere methoden omdat nu de (bijna) volledige sequentie beschikbaar is
- Biologische kennis
└ Sequentie en organisatie van bijna alle humane genen gekend
└ Vergelijkende genomics: inzicht in evolutie en in geconserveerde processen
└ Genetische verschillen tussen mensen
, Nieuwe uitdagingen:
- Volledige sequentie: telomeer tot telomeer
- Meer genomen sequencen van meerdere species
- Meer individuele humane sequenties
- Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
Enorme mogelijkheden voor ‘personalized precision medicine’:
- Kennis van DNA volgorde en SNPs diagnose, prognose & preventie
- Farmacogenomics: verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen goed/slecht reageren op
geneesmiddelen enorme impact op industrie
- Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen
- Therapie op maat (bv. kanker)
- Maar ook etische aspecten (werkgevers, verzekeringsmaatschappijen, …)
Probleem:
- Troughput en kosten
- Dus: verbeterde/ andere technologie nodig met hoge capaciteit en lage kosten
2de generatie sequentiebepaling
= short-read next generation sequencing
- Doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost
- Richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag
- 3 pijlers
1. Parallelle detectie
└ Cluster/polony maken = kopieën van een DNA template
└ Klonale in vitro amplificatie van template duizenden tot miljoenen kopieën van
DNA template per cluster
└ Multiplexing: vele cluster tegelijk
2. Miniaturisatie van reacties
3. Integratie van het proces
└ Alles geïntegreerd in 1 proces = pipline
└ Directe detectie mogelijk
- Gebaseerd op 4 stappen
1) Aanmaak DNA library
2) Klonale in vitro amplificatie
3) Sequentiebepaling
4) Data analyse
