Moleculaire diagnostiek
Les 1: imaging FISH & FRET
Algemeen
Van bench to bedside in translatonele research is gericht op het vinden van nieuwe medicijnen en/of
diagnostsche testen. Ook gepersonaliseerde testen/medicijnen komen hieruit voort.
De patint staat centraal het onderzoek de patint heef klachten en medicijnen werken
bijvoorbeeld niet waarom is dat? Waarom werkt het anders in een ander persoon? Een van de
eerste stappen die gedaan wordt als een patint binnenkomt voor onderzoek is het imagen. Om
antwoorden op deze wetenschappelijke vragen te vinden moet je als onderzoeker terug naar de
‘bench’. Op basis van dit onderzoek worden nieuwe/verbeterde medicijnen/diagnostsche testen
ontwikkeld dit moet vervolgens worden getest dit zijn de fase 1 en 2 trials (veiligheid). Hierna wordt
terug gegaan naar de patint om te kijken of de behandeling werkt. Als dit zo is dan kan door worden
gegaan naar fase 3 en 4 van de trials hierin wordt via een grote groep mensen gekeken of de
behandeling werkt of het werkt in alle patinten etc. Als er binnen de trial groepen verschillende
reactes op de behandelingen optreden zal terug naar de bench moeten worden gegaan (research)
om uit te zoeken waar dit verschil op berust.
Er zijn verschillende ‘soorten’ diagnoses/analyses: emergency presentatin (de patint komt binnen
met veel klachten de ziekte is dan al aanwezig) op basis van de klachten ga je dan onderzoeken wat
hier aan ten grondslag ligt. Een tweede manier van diagnose stellen is via screening dit wordt in
Nederland veel gedaan bijvoorbeeld via imaging: mammography colonscopie via laboratorium
testen: PAP-test CA-125 PSA of BRCA.
Alle te gebruiken testen moeten voldaan aan een aantal belangrijke kenmerken:
- Sensitef: detecteren van kleine hoeveelheden van een stof/molecuul/antgen etc zelfs in de
aanwezigheid van andere moleculen. De sensitviteit geef informate over het % vals
negateven.
- Specifek: alleen het molecuul van interesse wordt gedetecteerd. De specifciteit geef
informate over het % vals positeven.
- Goedkoop
- Heef de potente om een makkelijke gestandaardiseerde procedure te worden bijvoorbeeld
kan het worden geautomatseerd.
- Hoge doorvoer van data dus snelle verwerking
Om tot een diagnose te komen wordt over het algemeen op verschillende levels analyses uitgevoerd
dit start vaak met imaging (bepalen van de locate formaat) daarna wordt vaak een biopsie genomen
(bepalen karakteristeken van de tumor) hierna wordt dit is waar de research komt (benchside)
weefsel en vervolgens cellen geanalyseerd.
Imaging
Imaging wordt gebruikt om: een tumor te lokaliseren schaten van de ontwikkelingsfase observeren
van de groei plannen van een behandeling observeren of een behandeling werkt waar de
, medicijnen zich bevinden en het resultaat en intra vital imaging. Met intra vital imaging kun je
onderzoeken hoe medicijnen werken en hoe ze soms ook niet werken.
Er zijn veel verschillende methodes die gebruikt kunnen worden voor imaging. Op basis van de
onderzoeksvraag wordt voor een bepaalde methode gekozen iedere methode heef zijn voordelen
en nadelen. Een zowel een mammogram als een MRI tonen de aanwezigheid van een tumor maar de
resolute van een MRI scan is beter. Imaging is een goede basis methode om te bepalen of en waar
een tumor zich bevindt maar het geef verder niet veel antwoorden op vragen als: waarom groeit
deze tumor sneller dan een andere waarom is deze patint in vergelijkt met andere patinten
resistent tegen een specifeke behandeling waarom en hoe metastaseert deze tumor wel en andere
tumoren niet waarom komt deze tumor sneller terug dan een andere tumor etc. etc. Om
antwoorden op deze klinische vragen te krijgen moet er meer bekend zijn over de moleculaire basis
van de tumor hiervoor wordt onderzoek gedaan (bench). Misschien zijn er wel andere receptoren
aanwezig in een patint dan in een andere patint etc?
Als gebruik gemaakt kan worden dan hoef er (vaak) geen biopsie meer genomen te worden het
wordt daardoor minder invasief voor de patint.
Een van de mechanisme waardoor een tumor sneller kan groeien dan andere is als gevolg van de
aanwezigheid van de HER-2 receptor. Zodra een groeifactor bindt aan de receptor zal de tumor gaan
delen. Als je deze binding tegen kunt gaan dan zal je waarschijnlijk ook de groei/deling van de tumor
tegen gaan. Het is aangetoond dat patinten met een verhoogd copy number van HER-2 een kortere
overlevingsfase. Deze informate kun je meenemen in de ontwikkeling van een behandeling.
Dergelijke behandelingen zullen echter alleen een (positef) efect hebben op personen die
daadwerkelijk een verhoogd copy number van her HER-2 gen hebben.
Voor de start van de behandeling is het dus van belang om te testen op de aanwezigheid van
(verhoogd) HER-2. Een van de methode die hiervoor gebruikt kan worden is Fluorescent in situ
hybridisate ook wel FISH genoemd. Hierbij wordt een probe gehybridiseerd op een stukje weefsel
hiervoor moet dan wel een biopsie genomen worden.
De probes bestaan uit dubbelstrengs DNA dit is fuorescent gelabeld. Het dubbelstreng DNA moet
worden gedenatureerd om zo enkel strengs te worden dit geldt zowel voor de probes als het DNA
dat in het weefsel aanwezig is anders kan er geen hybridisate plaats vinden tussen probe en het te
onderzoeken weefsel/DNA. De probes hebben de zelfde sequente als het HER-2 gen en kunnen
indien aanwezig hieraan hechten als het sample met de probes wordt geïncubeerd. Met behulp van
fuorescente microscopie kan het sample nu worden geanalyseerd. ee kleurt de celkernen aan (zodat
je weet dat je in het juiste stuk zit te kijken) je neemt een controle probe mee (zodat je zeker weet
dat de staining lukt het kan natuurlijk zijn dat er geen HER-2 aanwezig is dan zal je ook niets zien. Als
je controle probe dan wel resultaat geef dan kan je aannemen dat er inderdaad geen HER-2 is. Maar
als je geen controle probe meeneemt dan weet je niet of de afwezigheid van HER-2 komt omdat dit
niet aanwezig is of omdat de methode niet heef gewerkt) en natuurlijk de probe voor HER-2.
Er is daadwerkelijk een behandeling ontwikkeld op basis van de HER-2 receptor: herceptn. Dit is een
monoklonaal antlichaam. Er is een positef efect gezien bij de groep patinten voor wie de
behandeling geschikt was maar toch waren er patinten bij wie er geen reacte optrad. De
onderzoekers moeten daarom weer terug naar de ‘bench’ om de oorzaak hiervan te achterhalen. Een
methode om dit te onderzoeken is via intravital imaging.
Met intravital imaging kun je kwantfceren hoe de drug delivery gaat en wat het efect is op enkele
cellen. Een methode om dit te doen is met muizen. De muizen hebben een soort kastje op hun rug
Les 1: imaging FISH & FRET
Algemeen
Van bench to bedside in translatonele research is gericht op het vinden van nieuwe medicijnen en/of
diagnostsche testen. Ook gepersonaliseerde testen/medicijnen komen hieruit voort.
De patint staat centraal het onderzoek de patint heef klachten en medicijnen werken
bijvoorbeeld niet waarom is dat? Waarom werkt het anders in een ander persoon? Een van de
eerste stappen die gedaan wordt als een patint binnenkomt voor onderzoek is het imagen. Om
antwoorden op deze wetenschappelijke vragen te vinden moet je als onderzoeker terug naar de
‘bench’. Op basis van dit onderzoek worden nieuwe/verbeterde medicijnen/diagnostsche testen
ontwikkeld dit moet vervolgens worden getest dit zijn de fase 1 en 2 trials (veiligheid). Hierna wordt
terug gegaan naar de patint om te kijken of de behandeling werkt. Als dit zo is dan kan door worden
gegaan naar fase 3 en 4 van de trials hierin wordt via een grote groep mensen gekeken of de
behandeling werkt of het werkt in alle patinten etc. Als er binnen de trial groepen verschillende
reactes op de behandelingen optreden zal terug naar de bench moeten worden gegaan (research)
om uit te zoeken waar dit verschil op berust.
Er zijn verschillende ‘soorten’ diagnoses/analyses: emergency presentatin (de patint komt binnen
met veel klachten de ziekte is dan al aanwezig) op basis van de klachten ga je dan onderzoeken wat
hier aan ten grondslag ligt. Een tweede manier van diagnose stellen is via screening dit wordt in
Nederland veel gedaan bijvoorbeeld via imaging: mammography colonscopie via laboratorium
testen: PAP-test CA-125 PSA of BRCA.
Alle te gebruiken testen moeten voldaan aan een aantal belangrijke kenmerken:
- Sensitef: detecteren van kleine hoeveelheden van een stof/molecuul/antgen etc zelfs in de
aanwezigheid van andere moleculen. De sensitviteit geef informate over het % vals
negateven.
- Specifek: alleen het molecuul van interesse wordt gedetecteerd. De specifciteit geef
informate over het % vals positeven.
- Goedkoop
- Heef de potente om een makkelijke gestandaardiseerde procedure te worden bijvoorbeeld
kan het worden geautomatseerd.
- Hoge doorvoer van data dus snelle verwerking
Om tot een diagnose te komen wordt over het algemeen op verschillende levels analyses uitgevoerd
dit start vaak met imaging (bepalen van de locate formaat) daarna wordt vaak een biopsie genomen
(bepalen karakteristeken van de tumor) hierna wordt dit is waar de research komt (benchside)
weefsel en vervolgens cellen geanalyseerd.
Imaging
Imaging wordt gebruikt om: een tumor te lokaliseren schaten van de ontwikkelingsfase observeren
van de groei plannen van een behandeling observeren of een behandeling werkt waar de
, medicijnen zich bevinden en het resultaat en intra vital imaging. Met intra vital imaging kun je
onderzoeken hoe medicijnen werken en hoe ze soms ook niet werken.
Er zijn veel verschillende methodes die gebruikt kunnen worden voor imaging. Op basis van de
onderzoeksvraag wordt voor een bepaalde methode gekozen iedere methode heef zijn voordelen
en nadelen. Een zowel een mammogram als een MRI tonen de aanwezigheid van een tumor maar de
resolute van een MRI scan is beter. Imaging is een goede basis methode om te bepalen of en waar
een tumor zich bevindt maar het geef verder niet veel antwoorden op vragen als: waarom groeit
deze tumor sneller dan een andere waarom is deze patint in vergelijkt met andere patinten
resistent tegen een specifeke behandeling waarom en hoe metastaseert deze tumor wel en andere
tumoren niet waarom komt deze tumor sneller terug dan een andere tumor etc. etc. Om
antwoorden op deze klinische vragen te krijgen moet er meer bekend zijn over de moleculaire basis
van de tumor hiervoor wordt onderzoek gedaan (bench). Misschien zijn er wel andere receptoren
aanwezig in een patint dan in een andere patint etc?
Als gebruik gemaakt kan worden dan hoef er (vaak) geen biopsie meer genomen te worden het
wordt daardoor minder invasief voor de patint.
Een van de mechanisme waardoor een tumor sneller kan groeien dan andere is als gevolg van de
aanwezigheid van de HER-2 receptor. Zodra een groeifactor bindt aan de receptor zal de tumor gaan
delen. Als je deze binding tegen kunt gaan dan zal je waarschijnlijk ook de groei/deling van de tumor
tegen gaan. Het is aangetoond dat patinten met een verhoogd copy number van HER-2 een kortere
overlevingsfase. Deze informate kun je meenemen in de ontwikkeling van een behandeling.
Dergelijke behandelingen zullen echter alleen een (positef) efect hebben op personen die
daadwerkelijk een verhoogd copy number van her HER-2 gen hebben.
Voor de start van de behandeling is het dus van belang om te testen op de aanwezigheid van
(verhoogd) HER-2. Een van de methode die hiervoor gebruikt kan worden is Fluorescent in situ
hybridisate ook wel FISH genoemd. Hierbij wordt een probe gehybridiseerd op een stukje weefsel
hiervoor moet dan wel een biopsie genomen worden.
De probes bestaan uit dubbelstrengs DNA dit is fuorescent gelabeld. Het dubbelstreng DNA moet
worden gedenatureerd om zo enkel strengs te worden dit geldt zowel voor de probes als het DNA
dat in het weefsel aanwezig is anders kan er geen hybridisate plaats vinden tussen probe en het te
onderzoeken weefsel/DNA. De probes hebben de zelfde sequente als het HER-2 gen en kunnen
indien aanwezig hieraan hechten als het sample met de probes wordt geïncubeerd. Met behulp van
fuorescente microscopie kan het sample nu worden geanalyseerd. ee kleurt de celkernen aan (zodat
je weet dat je in het juiste stuk zit te kijken) je neemt een controle probe mee (zodat je zeker weet
dat de staining lukt het kan natuurlijk zijn dat er geen HER-2 aanwezig is dan zal je ook niets zien. Als
je controle probe dan wel resultaat geef dan kan je aannemen dat er inderdaad geen HER-2 is. Maar
als je geen controle probe meeneemt dan weet je niet of de afwezigheid van HER-2 komt omdat dit
niet aanwezig is of omdat de methode niet heef gewerkt) en natuurlijk de probe voor HER-2.
Er is daadwerkelijk een behandeling ontwikkeld op basis van de HER-2 receptor: herceptn. Dit is een
monoklonaal antlichaam. Er is een positef efect gezien bij de groep patinten voor wie de
behandeling geschikt was maar toch waren er patinten bij wie er geen reacte optrad. De
onderzoekers moeten daarom weer terug naar de ‘bench’ om de oorzaak hiervan te achterhalen. Een
methode om dit te onderzoeken is via intravital imaging.
Met intravital imaging kun je kwantfceren hoe de drug delivery gaat en wat het efect is op enkele
cellen. Een methode om dit te doen is met muizen. De muizen hebben een soort kastje op hun rug
