Hoorcollege week 5; stabiliseren van eiwitten door vriesdrogen
• Aantal biologicals is toegenomen sinds 2013
• Meeste biologicals zijn Mabs
• Biologicals zijn vaak voor kleinere groep mensen en zijn erg duur (> 50
keuro/jr/patiënt)
Stabiliteit van eiwitten is een probleem!
Opbouw van eiwitten
• De werking van eiwitten is afhankelijk van zijn 3D structuur
• De eiwit 3D structuur is flexibel/dynamisch, zodat eiwitten hun boodschapper rol
kunnen vervullen
Twee types eiwit instabiliteit
• Fysisch instabiel:
o Verandering in de secundaire, tertiaire en/of quaternaire
structuur -> Aggregatie
o Getriggerd door chemische degradatie of denaturerende condities
• Chemisch instabiel, degradatie:
o Verandering(en) aan chemische bindingen. Dus aan de primaire structuur
o Verandering in primaire structuur kan leiden tot verandering in secundaire, tertiaire en/of
quaternaire structuur -> Aggregatie
o Getriggered door niet fysiologische condities, lucht (O2), en licht (UV, bindingen laten los)
,Instabiliteit leidt niet alleen tot verlies in effectiviteit, maar ook tot immuunreacties
• Eiwit verliest zijn werking / werking is verminderd
• De eiwit aggregaten kunnen leiden tot immuunreacties
Parentale toediening
Eiwitten worden parenteraal toegediend in waterige oplossingen
à Eiwitten kan je niet als tablet innemen door peptidase in de maag,
enzym speciaal om amidebindingen te breken.
Vereisten voor parenterale oplossing:
• Isotoon
• Steriel (geen microorganismen mogen erin)
• pH: Bij voorkeur pH 7,4
• Intraveneus 3-11 (1-5 mL/kg) , bloed werkt als buffer
dus wijde range
• Intramuscular (~5 mL) /subcutaan (~1.5 mL) 4-9 , het blijft waar het zit dus
minder wijde range qua hoeveelheid dus ook minder lichaamsvloeistof in bv
spieren om terug te brengen naar pH 7
• Lage buffer capaciteit
• Geen deeltjes bij intraveneus, tenzij heel klein (nano)
• Eiwit stabiel
Hoe worden eiwitten als API aangeleverd in de apotheek om er producten van te maken?
1. (Aan de lucht gedroogde) vaste stof
Geen waterige omgeving -> Verlies 3D structuur -> Aggregatie -> Immuunreactie
2. Als gevriesdroogde stof of product
Mogelijk. Echter mogelijke eiwit schade tijdens bevries stap
3. In (gestabiliseerde vorm) in oplossing Mogelijk. Echter eiwit is flexibel-> degradatie
mogelijk-> aggregatie -> Immuunreactie
• Gevriesdroogd en oplossing komen even vaak voor
• Hulpstoffen nodig om degradatie / aggregatie te voorkomen!
Gestabiliseerde oplossing
• Hulpstoffen toevoegen
• Voorzichtig behandelen (mechanische stress)
• In koelkast bewaren. Waarom? Bij kamertemperatuur denatureren.
• Niet invriezen (schade door vries-dooi cycli)
➢ Relatief goedkoop en makkelijke toediening
Gevriesdroogd product
• Ingevroren gestabiliseerde oplossing die vervolgens gedehydrateerd is
• Reconstitutie: Toevoegen van water geeft direct weer een heldere oplossing
• In vriezer bewaren
➢ Mogelijke schade tijdens vriesstap oplossing
➢ Duurder en ingewikkeldere toediening
,Shelf-life van oplossing en gevriesdroogd eiwit product
• Gevriesdroogde eiwit producten zijn in het algemeen stabieler
dan oplossingen en daarom veel langer houdbaar!
• Gecontroleerde cold-chain is niet nodig voor gevriesdroogde
eiwit producten
Vriesdrogen
= Verwijderen van water door sublimatie
Vriesdrogen kent meerdere stappen:
0. Kiezen van de juiste formulering -
1. Bevriezen Meest kritische stap. Langzaam en met
juiste hulpstoffen zodat eiwit 3D structuur
behouden blijft
2. Primair drogen Sublimatie. Kost veel tijd en energie. Deze
stap probeert men te optimaliseren à
‘Aggressive drying’
3. Secundair drogen Verdamping. Belangrijk dat je wel echt
genoeg water weghaalt. Anders alsnog
degradatie.
De ‘gevaren’ voor de
stabiliteit van eiwitten
tijdens bevriezen
• Dehydratie
• Eutectische
mengsels:
Verandering in
concentraties en pH
• Ijs-water grensvlak.
Precieze
mechanismen nog
onbekend
, Doel van hulpstoffen
• Chemisch en fysisch stabiel product
• Acceptabele poreuze cake structuur
(lage dichtheid, hoog poreus)
• Acceptabel reconstitutie tijd
• Acceptabel watergehalte
• Efficiënt vriesdroogproces qua tijd en
energieconsumptie
Þ Parentale toediening, dus keuze
hulpstoffen is beperkt. Waar aan
voldoen?
Þ Ideale hulpstof: Chemisch stabiel, inert
(niet reageren), veilig, multifunctioneel
en goedkoop
Functie en mechanisme van de hulpstoffen
Stabilisatoren: Bescherming tegen vriezen en drogen
• Amorfe materialen
• Vitrificatie: Immobilisatie van eiwit binnen een amorfe matrix
(kristallijn: fasescheiding eiwit en stabilisator).
Waarom zorgt immobilisatie voor stabiliteit?
• Water-substitutie
• Balans in Tg: Hoge Tg voor vitrificatie
& snel drogen, maar wel flexibel genoeg
(lagere Tg) voor goede H-brug vorming
à Als het water wordt weggehaald, zorgt
trehalose voor de waterstofbruggen zodat het
eiwit zijn vorm behoud
Bulking agents: Zorgen voor poreuze cake structuur en voldoende ‘gewicht’
• Kristallijne materialen
• Moeten kristalliseren gedurende vriesdrogen (annealing /
samenstelling). Anders mogelijk kristallisatie gedurende
opslag, waarbij water vrijkomt
• Waarom wil je poreuze structuur?
- Verkort de duur van het primaire drogen
- Verbetert de reconstitutie
(hoe poreuzer, hoe makkelijker het water erbij kan
door het vergrote oppervlak)
• Aantal biologicals is toegenomen sinds 2013
• Meeste biologicals zijn Mabs
• Biologicals zijn vaak voor kleinere groep mensen en zijn erg duur (> 50
keuro/jr/patiënt)
Stabiliteit van eiwitten is een probleem!
Opbouw van eiwitten
• De werking van eiwitten is afhankelijk van zijn 3D structuur
• De eiwit 3D structuur is flexibel/dynamisch, zodat eiwitten hun boodschapper rol
kunnen vervullen
Twee types eiwit instabiliteit
• Fysisch instabiel:
o Verandering in de secundaire, tertiaire en/of quaternaire
structuur -> Aggregatie
o Getriggerd door chemische degradatie of denaturerende condities
• Chemisch instabiel, degradatie:
o Verandering(en) aan chemische bindingen. Dus aan de primaire structuur
o Verandering in primaire structuur kan leiden tot verandering in secundaire, tertiaire en/of
quaternaire structuur -> Aggregatie
o Getriggered door niet fysiologische condities, lucht (O2), en licht (UV, bindingen laten los)
,Instabiliteit leidt niet alleen tot verlies in effectiviteit, maar ook tot immuunreacties
• Eiwit verliest zijn werking / werking is verminderd
• De eiwit aggregaten kunnen leiden tot immuunreacties
Parentale toediening
Eiwitten worden parenteraal toegediend in waterige oplossingen
à Eiwitten kan je niet als tablet innemen door peptidase in de maag,
enzym speciaal om amidebindingen te breken.
Vereisten voor parenterale oplossing:
• Isotoon
• Steriel (geen microorganismen mogen erin)
• pH: Bij voorkeur pH 7,4
• Intraveneus 3-11 (1-5 mL/kg) , bloed werkt als buffer
dus wijde range
• Intramuscular (~5 mL) /subcutaan (~1.5 mL) 4-9 , het blijft waar het zit dus
minder wijde range qua hoeveelheid dus ook minder lichaamsvloeistof in bv
spieren om terug te brengen naar pH 7
• Lage buffer capaciteit
• Geen deeltjes bij intraveneus, tenzij heel klein (nano)
• Eiwit stabiel
Hoe worden eiwitten als API aangeleverd in de apotheek om er producten van te maken?
1. (Aan de lucht gedroogde) vaste stof
Geen waterige omgeving -> Verlies 3D structuur -> Aggregatie -> Immuunreactie
2. Als gevriesdroogde stof of product
Mogelijk. Echter mogelijke eiwit schade tijdens bevries stap
3. In (gestabiliseerde vorm) in oplossing Mogelijk. Echter eiwit is flexibel-> degradatie
mogelijk-> aggregatie -> Immuunreactie
• Gevriesdroogd en oplossing komen even vaak voor
• Hulpstoffen nodig om degradatie / aggregatie te voorkomen!
Gestabiliseerde oplossing
• Hulpstoffen toevoegen
• Voorzichtig behandelen (mechanische stress)
• In koelkast bewaren. Waarom? Bij kamertemperatuur denatureren.
• Niet invriezen (schade door vries-dooi cycli)
➢ Relatief goedkoop en makkelijke toediening
Gevriesdroogd product
• Ingevroren gestabiliseerde oplossing die vervolgens gedehydrateerd is
• Reconstitutie: Toevoegen van water geeft direct weer een heldere oplossing
• In vriezer bewaren
➢ Mogelijke schade tijdens vriesstap oplossing
➢ Duurder en ingewikkeldere toediening
,Shelf-life van oplossing en gevriesdroogd eiwit product
• Gevriesdroogde eiwit producten zijn in het algemeen stabieler
dan oplossingen en daarom veel langer houdbaar!
• Gecontroleerde cold-chain is niet nodig voor gevriesdroogde
eiwit producten
Vriesdrogen
= Verwijderen van water door sublimatie
Vriesdrogen kent meerdere stappen:
0. Kiezen van de juiste formulering -
1. Bevriezen Meest kritische stap. Langzaam en met
juiste hulpstoffen zodat eiwit 3D structuur
behouden blijft
2. Primair drogen Sublimatie. Kost veel tijd en energie. Deze
stap probeert men te optimaliseren à
‘Aggressive drying’
3. Secundair drogen Verdamping. Belangrijk dat je wel echt
genoeg water weghaalt. Anders alsnog
degradatie.
De ‘gevaren’ voor de
stabiliteit van eiwitten
tijdens bevriezen
• Dehydratie
• Eutectische
mengsels:
Verandering in
concentraties en pH
• Ijs-water grensvlak.
Precieze
mechanismen nog
onbekend
, Doel van hulpstoffen
• Chemisch en fysisch stabiel product
• Acceptabele poreuze cake structuur
(lage dichtheid, hoog poreus)
• Acceptabel reconstitutie tijd
• Acceptabel watergehalte
• Efficiënt vriesdroogproces qua tijd en
energieconsumptie
Þ Parentale toediening, dus keuze
hulpstoffen is beperkt. Waar aan
voldoen?
Þ Ideale hulpstof: Chemisch stabiel, inert
(niet reageren), veilig, multifunctioneel
en goedkoop
Functie en mechanisme van de hulpstoffen
Stabilisatoren: Bescherming tegen vriezen en drogen
• Amorfe materialen
• Vitrificatie: Immobilisatie van eiwit binnen een amorfe matrix
(kristallijn: fasescheiding eiwit en stabilisator).
Waarom zorgt immobilisatie voor stabiliteit?
• Water-substitutie
• Balans in Tg: Hoge Tg voor vitrificatie
& snel drogen, maar wel flexibel genoeg
(lagere Tg) voor goede H-brug vorming
à Als het water wordt weggehaald, zorgt
trehalose voor de waterstofbruggen zodat het
eiwit zijn vorm behoud
Bulking agents: Zorgen voor poreuze cake structuur en voldoende ‘gewicht’
• Kristallijne materialen
• Moeten kristalliseren gedurende vriesdrogen (annealing /
samenstelling). Anders mogelijk kristallisatie gedurende
opslag, waarbij water vrijkomt
• Waarom wil je poreuze structuur?
- Verkort de duur van het primaire drogen
- Verbetert de reconstitutie
(hoe poreuzer, hoe makkelijker het water erbij kan
door het vergrote oppervlak)
