Early drug discovery (Dewitte)
Biologie
• In vitro antiproliferation assay (cellen)
o Giso = grove inhibitoren: concentratie die 50% van de cellen inhibeert
1. Cellen in wells via steriel medium
2. Incubator → proliferatie
3. Indicator die gemetaboliseerd wordt → meer kleur = meer proliferatie
4. Inhibitor toevoegen → verschil in kleur meten
• In vivo antitumoral assay (dieren)
o Gevoelige cellen bij naakte immuundeficiëntie muizen inspuiten en verbinding toedienen
• In vitro kinase assay (enzyme)
o Kinase receptoren vaak belangrijk voor proliferatie
▪ Mutaties → constitutief actief of amplificatie (meer expressie) → continue
groeisignalen
▪ → Inhibitie receptoren om kanker tegen te gaan
1. Peptide in wells → + tyrosine kinase + ATP → fosforylatie peptide
2. + indicator met HRP (antilichaam gericht tegen gefosforyleerd peptide)
3. + TMB (substraat voor HRP) → blauwe kleur
4. Inhibitor toevoegen (inhibeert fosforylatie) → verschil in blauwe kleur meten
• In vitro kinase assay (reporter cell line)
1. Expressie tyrosinekinase receptor met klein deel B-galactosidase + fusieproteine SH2 met
groter deel B-galactosidase
2. Ligand bindt op receptor → autofosforylering van tyrosineresidus→ recrutering SH2
3. Actief B-Gal enzyme waar tyrosinekinase actief is
4. + lugal (bevat galactose) → galactose + D-luciferine (kleurloos)
5. + luciferase (reporter) → licht
6. Inhibitor toevoegen (inhibeert ligandbinding/fosforylatie) → verschil in intensiteit meten
o Intensiteit is proportioneel aan #actief B-Gal en dus aan kinase activiteit
o HTS (highthroughputscreening) om alles te versnellen en automatiseren
• In silico drug design (PC): ontwerpen op basis van receptorstructuur
Manieren van DD
• Fenotypische benadering (PDD)
o Empirische, “holistische” methode gebaseerd op observeerbare karakteristieken (read-
outs) van een organisme (cel, dier)
o Voordelen
▪ Target-agnostic, “target-unbiased” → geen kennis van patho-mechanistische
moleculaire details nodig
▪ Indien in vivo: indirect ook ADMET getest
o Nadelen
▪ Geen kennis van target → hoe structuur optimaliseren? (geen in silico mogelijk)
▪ In vivo: vaak “low throughput”
, • Target benadering (TDD)
o Rationale, “moleculaire” → gebaseerd op kennis van patho-mechanistische details
o Voordelen
▪ “high throughput” mogelijk
▪ MoAbs-benadering mogelijk
▪ Rationele methode (fundamenteel onderzoek)
o Nadelen
▪ Reductionistische benadering (je kijkt niet naar hele cel/proces dus target moet
gevalideerd zijn)
• Validatie: doelgerichte mutatie/inhibitie tegen genen, mRNA of proteïne
→ geen expressie proteïne → hoe verandert de cel?
• Vergelijking
• Zogezegd meer first-in class via PDD, maar biologics zijn ook target-based
• Snellere optimalisatie via TDD
• Nood aan mechanistisch onderbouwde PDD
• Bepalende factor voor PDD-succes: screening test voorspelt therapeutisch nut van
geselecteerd molecule (predictive validity) → goede chain of translatability nodig
o Goede chain of translatability als
▪ Gemeenschappelijke mechanistische basis bestaat tussen ziektemodel en
pathofysiologie
▪ Assay-endpoint (readout) en ziekte-indicator (klinisch) overeenstemmen
• Chain of translatability bij PDD
o Goed voor
▪ Infectieuze ziekten (bacteriën, virussen, parasieten)
▪ Duidelijk causaal verband tussen proteine en ziekte (bv. diabetes)
▪ Monogene ziekten (1 gen bv. mucoviscidose)
o Slecht voor
▪ Oncologie
▪ Neurowetenschappen
Verbeteren translatability
• Geen exogene stimulus (om echte situatie te simuleren)
o Niet helemaal waar want exogene stimuli hebben nut
o Antidepressiva worden getest op basis van sparteltijd van een muis → slechte simulatie
o Anti-epileptica worden getest op basis van shocks → slechte simulatie
• Gebruik van 3D-celsystemen en co-culturen → betere morfologische simulatie
• Gebruik van primaire (van patiënt) en pluripotente stamcellen (PSC, organoïden van patiënt)
o Huidige kankercellen worden al lang gebruikt → lijken ondertussen niet meer op originele
cel door genetische instabiliteit → slechte simulatie
• Moleculaire fenotypering (kan GM observeerbaar ziekte verbeteren in cel?)
o Cellulair: morfologie, proteïne aggregatie, glycogeen en lipide accumulatie, apoptose, ...
o Fysiologisch: elektrofysiologische read-outs, ....
o Moleculair: transcriptoom, proteoom, epigenetische markers, ...
• Zebravis als preklinisch model (gevalideerd voor fenflumarine (anti-epilepticum))
Biologie
• In vitro antiproliferation assay (cellen)
o Giso = grove inhibitoren: concentratie die 50% van de cellen inhibeert
1. Cellen in wells via steriel medium
2. Incubator → proliferatie
3. Indicator die gemetaboliseerd wordt → meer kleur = meer proliferatie
4. Inhibitor toevoegen → verschil in kleur meten
• In vivo antitumoral assay (dieren)
o Gevoelige cellen bij naakte immuundeficiëntie muizen inspuiten en verbinding toedienen
• In vitro kinase assay (enzyme)
o Kinase receptoren vaak belangrijk voor proliferatie
▪ Mutaties → constitutief actief of amplificatie (meer expressie) → continue
groeisignalen
▪ → Inhibitie receptoren om kanker tegen te gaan
1. Peptide in wells → + tyrosine kinase + ATP → fosforylatie peptide
2. + indicator met HRP (antilichaam gericht tegen gefosforyleerd peptide)
3. + TMB (substraat voor HRP) → blauwe kleur
4. Inhibitor toevoegen (inhibeert fosforylatie) → verschil in blauwe kleur meten
• In vitro kinase assay (reporter cell line)
1. Expressie tyrosinekinase receptor met klein deel B-galactosidase + fusieproteine SH2 met
groter deel B-galactosidase
2. Ligand bindt op receptor → autofosforylering van tyrosineresidus→ recrutering SH2
3. Actief B-Gal enzyme waar tyrosinekinase actief is
4. + lugal (bevat galactose) → galactose + D-luciferine (kleurloos)
5. + luciferase (reporter) → licht
6. Inhibitor toevoegen (inhibeert ligandbinding/fosforylatie) → verschil in intensiteit meten
o Intensiteit is proportioneel aan #actief B-Gal en dus aan kinase activiteit
o HTS (highthroughputscreening) om alles te versnellen en automatiseren
• In silico drug design (PC): ontwerpen op basis van receptorstructuur
Manieren van DD
• Fenotypische benadering (PDD)
o Empirische, “holistische” methode gebaseerd op observeerbare karakteristieken (read-
outs) van een organisme (cel, dier)
o Voordelen
▪ Target-agnostic, “target-unbiased” → geen kennis van patho-mechanistische
moleculaire details nodig
▪ Indien in vivo: indirect ook ADMET getest
o Nadelen
▪ Geen kennis van target → hoe structuur optimaliseren? (geen in silico mogelijk)
▪ In vivo: vaak “low throughput”
, • Target benadering (TDD)
o Rationale, “moleculaire” → gebaseerd op kennis van patho-mechanistische details
o Voordelen
▪ “high throughput” mogelijk
▪ MoAbs-benadering mogelijk
▪ Rationele methode (fundamenteel onderzoek)
o Nadelen
▪ Reductionistische benadering (je kijkt niet naar hele cel/proces dus target moet
gevalideerd zijn)
• Validatie: doelgerichte mutatie/inhibitie tegen genen, mRNA of proteïne
→ geen expressie proteïne → hoe verandert de cel?
• Vergelijking
• Zogezegd meer first-in class via PDD, maar biologics zijn ook target-based
• Snellere optimalisatie via TDD
• Nood aan mechanistisch onderbouwde PDD
• Bepalende factor voor PDD-succes: screening test voorspelt therapeutisch nut van
geselecteerd molecule (predictive validity) → goede chain of translatability nodig
o Goede chain of translatability als
▪ Gemeenschappelijke mechanistische basis bestaat tussen ziektemodel en
pathofysiologie
▪ Assay-endpoint (readout) en ziekte-indicator (klinisch) overeenstemmen
• Chain of translatability bij PDD
o Goed voor
▪ Infectieuze ziekten (bacteriën, virussen, parasieten)
▪ Duidelijk causaal verband tussen proteine en ziekte (bv. diabetes)
▪ Monogene ziekten (1 gen bv. mucoviscidose)
o Slecht voor
▪ Oncologie
▪ Neurowetenschappen
Verbeteren translatability
• Geen exogene stimulus (om echte situatie te simuleren)
o Niet helemaal waar want exogene stimuli hebben nut
o Antidepressiva worden getest op basis van sparteltijd van een muis → slechte simulatie
o Anti-epileptica worden getest op basis van shocks → slechte simulatie
• Gebruik van 3D-celsystemen en co-culturen → betere morfologische simulatie
• Gebruik van primaire (van patiënt) en pluripotente stamcellen (PSC, organoïden van patiënt)
o Huidige kankercellen worden al lang gebruikt → lijken ondertussen niet meer op originele
cel door genetische instabiliteit → slechte simulatie
• Moleculaire fenotypering (kan GM observeerbaar ziekte verbeteren in cel?)
o Cellulair: morfologie, proteïne aggregatie, glycogeen en lipide accumulatie, apoptose, ...
o Fysiologisch: elektrofysiologische read-outs, ....
o Moleculair: transcriptoom, proteoom, epigenetische markers, ...
• Zebravis als preklinisch model (gevalideerd voor fenflumarine (anti-epilepticum))
