Hoofdstuk 1: Nucleus-genoom 3D organisatie
Nucleaire compartimentalisatie
Eukaryote genomen = 1000x genoom bacteriën
- Eukaryote genomen bevatten veel regulatorisch DNA/RNA
- Eukaryote genomen coderen voor multicellulaire ontwikkeling
Waarom hebben we nucleaire compartimentalisatie? Een nucleus is geen aquarium waarin alles
ongeordend rondzweeft, maar alles heeft een eigen plekje. Genen die gecoreguleerd zijn, worden
gebundeld in transcriptie factories. Er is een tijdsgebonden
verandering in de organisatie van de nucleus: bij differentiatie gaat er
nucleaire reorganisatie gebeuren in functie van de tijd.
Het genoom heeft bepaalde functies. Verschillende cellen hebben
andere uiting van genoom, dus heeft de kern ook een soort
stockeringsfunctie.
Als we DNA kleuren van verschillende chromosomen dan krijg je een
beeld zoals hiernaast, elk stukje zit in zijn eigen territorium. Je kan ook
op verschillende niveaus DNA gaan organiseren:
- DNA -> dubbele helix, bestaande uit 4 basen.
- Nucleosomen (histonen) -> efficiënte opvouwing is cruciaal, daarom wordt het DNA rondom
nucleosomen gewikkeld. Elk nucleosoom bestaat uit 8 histonen waarrond het DNA wordt
gewikkeld.
- Lusdomeinen -> de vezels die door de nucleosomen gevormd worden, worden opgevouwen
in lussen. De lussen worden in stand gehouden door geregelde hechting van DNA aan een
onoplosbaar netwerk van niet-histon proteïnen. Door de lusdomeinen kunnen gebieden die
ver van elkaar liggen in het lineaire chromosoom samen worden gebracht in de 3D ruimte tot
topologische geconcentreerde domeinen (transcription factories).
- TAD -> topologically associated domain, hoge verhouding van chromosomale contracten
binnen het domein en bevatten veel chromatinelussen. TADs correleren met regulatie van
genexpressie.
- LADs -> lamin associated domain, zijn vooral de genarme regio’s en bevinden zich aan de
periferie. Lamines regelen heterochromatine lusopvouwing. Lamine is een bescherming voor
het inactief DNA.
Oxidatieve stress kan zorgen voor corrosie van de lamine en dan kan het gebeuren dat de chromatine
eiwitten de grip verliezen op de lamine structuur -> dan kan het gebeuren dat sommige van de LAD
geen LAD meer zijn maar per ongeluk een TAD worden.
Het DNA moet zich op deze manier opvouwen om zich te beschermen van stressfactoren.
De modulariteit in chromosoomorganisatie en genexpressie hangt af van de nucleaire mechanische
toestand. Mechanosensing van de extracellulaire signalen uit de micro-omgeving resulteert in
activering van specifieke transcriptiefactoren en modulatie van de cytoskelet-nucleusverbindingen.
Dit leidt tot de rangschikking van bepaalde chromosomen. De specifieke configuraties van chromatine
en posttranslationele modificaties zijn belangrijk voor het begeleiden van transcriptiefactoren naar
hun target-genen en het verkrijgen van optimale transcriptionel outputs om cellulaire homeostase te
behouden.
Onder invloed van stress kunnen bepaalde spikkels ontstaan welke invloed hebben op nucleaire
fluïditeit. Structurele eiwitten die het nucleair cytoskelet vormen (en van belang zijn bij de
mechanosensing) zijn gekoppeld aal lamine. Nucleaire lamines zorgen ook voor contacten met het
cytoskelet. De nucleoskelet eiwitten reageren op mechanosensing. Zowel de genexpressie als de LAD-
en TAD-organisatie wordt beïnvloed door mechanische stress. Mechanische stress wordt
1
,waargenomen in de filamenteuze eiwitten. Deze zijn gekoppeld aan lamines, en de lamines spelen
een grote rol bij de organisatie van het genoom, meer specifiek de TADs en LADs. Door een andere
organisatie van het genoom krijgen we ook een ander regulatiepatroon.
Chromosomen kunnen gevisualiseerd worden in territoria
Het genoom kan gezien worden als een soort 3D machinerie om genen tot expressie te brengen. De
genactiviteit is sterk afhankelijk van de 3D structuur van dat genoom. Je kan dit vergelijken met
enzymactiviteit die ook sterk afhankelijk is van de 3D conformatie.
- De chromosomen nemen hun eigen territorium in binnen de kern
- De opvouwing van ons DNA en opvouwing van chromatinedomeinen -> zorgt ervoor dat de
densiteit/elasticiteit van de nucleus varieert
o We hebben verschillende densiteiten
o Veel compact, inactief chromatine -> viskeuzer milieu
o Veel los, actief chromatine -> waterig milieu
- De genactivatie en repressie kunnen dus gereguleerd worden door de fluïditeit en er kan een
fluïditeitsgradiënt gevormd worden
- Gentranscriptiefactoren kunnen binden op DNA -> de binding kan bepaald worden door
fluïditeit van de vloeistof in de nucleus
- Acetylatie van chromatine eiwitten -> elektrostatische lading veranderen van die chromatine
eiwitten dus ook de viscositeit in de omgeving van dat DNA veranderen
- Genactivatie heeft dus veel te maken met de diffusie eigenschappen van transcriptiefactoren
in de verschillende fasen van de nucleus
Nucleaire fluïditeit: fase-separatie door chromatineveranderingen
Chromatinestructuur regelt faseveranderingen in fluïditeit en
transcription factories
Afhankelijk van de chromatine-toestand zal de viscositeit en
fluïditeit in de nucleus veranderen. Hierdoor veranderen dus ook de
genactivatie en genrepressie eigenschappen.
Bij het gebruik van immunofluorescenteitechnieken voor de
lokalisatie van bepaalde transcriptie/epigenetische factoren zal je
soms puntjes zien (=transcription factories) -> bubbels of
faseverandering in de celkern waar hogere concentratie is van
transcriptiefactoren/chromatinecomplexen om genen aan/uit te
zetten.
Wat zit er in de nuclear bodies? Chromatine eiwitten die een rol
spelen bij de genrepressie of genactivatie.
De trend van aggregatie varieert met ouderdom van de cel -> een cel die naar senescentie gaat gaan
er aggregaties optreden in een conditie die niet meer gunstig is en deze zullen niet meer normaal
functioneren.
Fasescheiding is een fysisch proces waarbij moleculen zich van hun omgeving kunnen scheiden.
Kristallisatie van oplosbare proteïnen en RNA-moleculen is bijvoorbeeld een vorm van fasescheiding
die door structuurbiologen wordt gebruikt om structuren van biomoleculen op te lossen. Het centrale
definiërende kenmerk van een kerncompartiment: de verrijking van specifieke moleculen binnen een
specifiek gebied.
Chromosomen worden in lussen gebracht om in kleine gebiedjes te organiseren: elk gebied gaat een
bepaald proces reguleren. In bacteriën is er ook geen homogene vloeistof, maar een verschil in
fluïditeit. De faseveranderingen in de nucleus zijn minder drastisch.
2
,Chromatine organisatie draagt bij aan de fluïditeit van de lussen: transcriptiefactoren die wel of niet
diffunderen naar het DNA. De faseveranderingen hebben te maken met de fluïditeit waarin de
moleculen kunnen bewegen. De viscositeit zorgt niet enkel voor regulatie van transcriptieprocessen,
maar ook voor bescherming van het DNA tegen corrosie.
Waar bevindt zich het actieve DNA en waar het inactieve? De
meeste genen die inactief zijn zitten meestal aan de periferie
dicht bij de nucleaire lamines, terwijl de actieve genen
meestal in het centrum zitten.
Bij genactivatie moeten lussen uit
LADs gelokaliseerd worden naar
het centrum.
De TADs kunnen overlappen met
spikkels die heel rijk zijn aan
splicing, ze kunnen verschillende
functionaliteiten hebben.
Distributie van genrijke en genarme regio’s in nucleus is niet homogeen
Fluorescentie opnames tonen duidelijke densiteitsverschillen in de nucleus.
- Merkers voor euchromatine = actief overgeschreven DNA
- Merkers voor heterochromatine = silenced DNA
De chromatine in een kern kan gekleurd worden, waarbij
euchromatine lichter van kleur is en heterochromatine donkerder
van kleur is.
De verhouding euchromatine/heterochromatine correleert met
biosynthetische status van de cel.
Opnames met fluorescente probes voor alle
individuele chromosomen tonen dat ze elk hun eigen
domein/sector binnen de nucleus innemen.
Genoomopvouwing 3D: TADs, LADs
Nucleaire subcompartimentalisatie van actieve genoomdomeinen via lussen
Er is een speciale methode ontwikkeld die wordt gebruikt voor de analyse van genoomarchitectuur.
Het reconstrueert welke genen samen gereguleerd worden, welke genen samen in 1 gebied, in 1
transcription factory zitten -> 3C technologie (Chromosome Conformation Capture technology)
3
, Celkernen in 2 verschillende condities -> in beide gevallen
lijkt het een kom spaghetti, daarom dat de 3C methode is
ontwikkeld.
Lusvorming van actieve DNA-lussen
- Lussen kunnen ook communiceren met lussen
van andere chromosomen
Je ziet aantal sequenties dat contact maakt met de
nucleaire matrix of nucleaire lamines -> matrix
attachment regions/scaffold regions
- = sequenties die eigenlijk een soort
verankeringsfunctie hebben aan de lamines
We willen weten welke stukjes DNA tegenover elkaar komen te liggen
Verschillende graden van chromosomale ‘lus’-densiteit
4
Nucleaire compartimentalisatie
Eukaryote genomen = 1000x genoom bacteriën
- Eukaryote genomen bevatten veel regulatorisch DNA/RNA
- Eukaryote genomen coderen voor multicellulaire ontwikkeling
Waarom hebben we nucleaire compartimentalisatie? Een nucleus is geen aquarium waarin alles
ongeordend rondzweeft, maar alles heeft een eigen plekje. Genen die gecoreguleerd zijn, worden
gebundeld in transcriptie factories. Er is een tijdsgebonden
verandering in de organisatie van de nucleus: bij differentiatie gaat er
nucleaire reorganisatie gebeuren in functie van de tijd.
Het genoom heeft bepaalde functies. Verschillende cellen hebben
andere uiting van genoom, dus heeft de kern ook een soort
stockeringsfunctie.
Als we DNA kleuren van verschillende chromosomen dan krijg je een
beeld zoals hiernaast, elk stukje zit in zijn eigen territorium. Je kan ook
op verschillende niveaus DNA gaan organiseren:
- DNA -> dubbele helix, bestaande uit 4 basen.
- Nucleosomen (histonen) -> efficiënte opvouwing is cruciaal, daarom wordt het DNA rondom
nucleosomen gewikkeld. Elk nucleosoom bestaat uit 8 histonen waarrond het DNA wordt
gewikkeld.
- Lusdomeinen -> de vezels die door de nucleosomen gevormd worden, worden opgevouwen
in lussen. De lussen worden in stand gehouden door geregelde hechting van DNA aan een
onoplosbaar netwerk van niet-histon proteïnen. Door de lusdomeinen kunnen gebieden die
ver van elkaar liggen in het lineaire chromosoom samen worden gebracht in de 3D ruimte tot
topologische geconcentreerde domeinen (transcription factories).
- TAD -> topologically associated domain, hoge verhouding van chromosomale contracten
binnen het domein en bevatten veel chromatinelussen. TADs correleren met regulatie van
genexpressie.
- LADs -> lamin associated domain, zijn vooral de genarme regio’s en bevinden zich aan de
periferie. Lamines regelen heterochromatine lusopvouwing. Lamine is een bescherming voor
het inactief DNA.
Oxidatieve stress kan zorgen voor corrosie van de lamine en dan kan het gebeuren dat de chromatine
eiwitten de grip verliezen op de lamine structuur -> dan kan het gebeuren dat sommige van de LAD
geen LAD meer zijn maar per ongeluk een TAD worden.
Het DNA moet zich op deze manier opvouwen om zich te beschermen van stressfactoren.
De modulariteit in chromosoomorganisatie en genexpressie hangt af van de nucleaire mechanische
toestand. Mechanosensing van de extracellulaire signalen uit de micro-omgeving resulteert in
activering van specifieke transcriptiefactoren en modulatie van de cytoskelet-nucleusverbindingen.
Dit leidt tot de rangschikking van bepaalde chromosomen. De specifieke configuraties van chromatine
en posttranslationele modificaties zijn belangrijk voor het begeleiden van transcriptiefactoren naar
hun target-genen en het verkrijgen van optimale transcriptionel outputs om cellulaire homeostase te
behouden.
Onder invloed van stress kunnen bepaalde spikkels ontstaan welke invloed hebben op nucleaire
fluïditeit. Structurele eiwitten die het nucleair cytoskelet vormen (en van belang zijn bij de
mechanosensing) zijn gekoppeld aal lamine. Nucleaire lamines zorgen ook voor contacten met het
cytoskelet. De nucleoskelet eiwitten reageren op mechanosensing. Zowel de genexpressie als de LAD-
en TAD-organisatie wordt beïnvloed door mechanische stress. Mechanische stress wordt
1
,waargenomen in de filamenteuze eiwitten. Deze zijn gekoppeld aan lamines, en de lamines spelen
een grote rol bij de organisatie van het genoom, meer specifiek de TADs en LADs. Door een andere
organisatie van het genoom krijgen we ook een ander regulatiepatroon.
Chromosomen kunnen gevisualiseerd worden in territoria
Het genoom kan gezien worden als een soort 3D machinerie om genen tot expressie te brengen. De
genactiviteit is sterk afhankelijk van de 3D structuur van dat genoom. Je kan dit vergelijken met
enzymactiviteit die ook sterk afhankelijk is van de 3D conformatie.
- De chromosomen nemen hun eigen territorium in binnen de kern
- De opvouwing van ons DNA en opvouwing van chromatinedomeinen -> zorgt ervoor dat de
densiteit/elasticiteit van de nucleus varieert
o We hebben verschillende densiteiten
o Veel compact, inactief chromatine -> viskeuzer milieu
o Veel los, actief chromatine -> waterig milieu
- De genactivatie en repressie kunnen dus gereguleerd worden door de fluïditeit en er kan een
fluïditeitsgradiënt gevormd worden
- Gentranscriptiefactoren kunnen binden op DNA -> de binding kan bepaald worden door
fluïditeit van de vloeistof in de nucleus
- Acetylatie van chromatine eiwitten -> elektrostatische lading veranderen van die chromatine
eiwitten dus ook de viscositeit in de omgeving van dat DNA veranderen
- Genactivatie heeft dus veel te maken met de diffusie eigenschappen van transcriptiefactoren
in de verschillende fasen van de nucleus
Nucleaire fluïditeit: fase-separatie door chromatineveranderingen
Chromatinestructuur regelt faseveranderingen in fluïditeit en
transcription factories
Afhankelijk van de chromatine-toestand zal de viscositeit en
fluïditeit in de nucleus veranderen. Hierdoor veranderen dus ook de
genactivatie en genrepressie eigenschappen.
Bij het gebruik van immunofluorescenteitechnieken voor de
lokalisatie van bepaalde transcriptie/epigenetische factoren zal je
soms puntjes zien (=transcription factories) -> bubbels of
faseverandering in de celkern waar hogere concentratie is van
transcriptiefactoren/chromatinecomplexen om genen aan/uit te
zetten.
Wat zit er in de nuclear bodies? Chromatine eiwitten die een rol
spelen bij de genrepressie of genactivatie.
De trend van aggregatie varieert met ouderdom van de cel -> een cel die naar senescentie gaat gaan
er aggregaties optreden in een conditie die niet meer gunstig is en deze zullen niet meer normaal
functioneren.
Fasescheiding is een fysisch proces waarbij moleculen zich van hun omgeving kunnen scheiden.
Kristallisatie van oplosbare proteïnen en RNA-moleculen is bijvoorbeeld een vorm van fasescheiding
die door structuurbiologen wordt gebruikt om structuren van biomoleculen op te lossen. Het centrale
definiërende kenmerk van een kerncompartiment: de verrijking van specifieke moleculen binnen een
specifiek gebied.
Chromosomen worden in lussen gebracht om in kleine gebiedjes te organiseren: elk gebied gaat een
bepaald proces reguleren. In bacteriën is er ook geen homogene vloeistof, maar een verschil in
fluïditeit. De faseveranderingen in de nucleus zijn minder drastisch.
2
,Chromatine organisatie draagt bij aan de fluïditeit van de lussen: transcriptiefactoren die wel of niet
diffunderen naar het DNA. De faseveranderingen hebben te maken met de fluïditeit waarin de
moleculen kunnen bewegen. De viscositeit zorgt niet enkel voor regulatie van transcriptieprocessen,
maar ook voor bescherming van het DNA tegen corrosie.
Waar bevindt zich het actieve DNA en waar het inactieve? De
meeste genen die inactief zijn zitten meestal aan de periferie
dicht bij de nucleaire lamines, terwijl de actieve genen
meestal in het centrum zitten.
Bij genactivatie moeten lussen uit
LADs gelokaliseerd worden naar
het centrum.
De TADs kunnen overlappen met
spikkels die heel rijk zijn aan
splicing, ze kunnen verschillende
functionaliteiten hebben.
Distributie van genrijke en genarme regio’s in nucleus is niet homogeen
Fluorescentie opnames tonen duidelijke densiteitsverschillen in de nucleus.
- Merkers voor euchromatine = actief overgeschreven DNA
- Merkers voor heterochromatine = silenced DNA
De chromatine in een kern kan gekleurd worden, waarbij
euchromatine lichter van kleur is en heterochromatine donkerder
van kleur is.
De verhouding euchromatine/heterochromatine correleert met
biosynthetische status van de cel.
Opnames met fluorescente probes voor alle
individuele chromosomen tonen dat ze elk hun eigen
domein/sector binnen de nucleus innemen.
Genoomopvouwing 3D: TADs, LADs
Nucleaire subcompartimentalisatie van actieve genoomdomeinen via lussen
Er is een speciale methode ontwikkeld die wordt gebruikt voor de analyse van genoomarchitectuur.
Het reconstrueert welke genen samen gereguleerd worden, welke genen samen in 1 gebied, in 1
transcription factory zitten -> 3C technologie (Chromosome Conformation Capture technology)
3
, Celkernen in 2 verschillende condities -> in beide gevallen
lijkt het een kom spaghetti, daarom dat de 3C methode is
ontwikkeld.
Lusvorming van actieve DNA-lussen
- Lussen kunnen ook communiceren met lussen
van andere chromosomen
Je ziet aantal sequenties dat contact maakt met de
nucleaire matrix of nucleaire lamines -> matrix
attachment regions/scaffold regions
- = sequenties die eigenlijk een soort
verankeringsfunctie hebben aan de lamines
We willen weten welke stukjes DNA tegenover elkaar komen te liggen
Verschillende graden van chromosomale ‘lus’-densiteit
4
