Hoofdstuk 1. Inleiding
§2. Totipotentie
Meristematische cellen produceren stengels, wortels en geslachtscellen. Ze zijn totipotent
Somatische cellen kunnen specifieke functies vervullen in het orgaan waar ze in voorkomen
en kunnen niet dele. Ze zijn afkomstig van meristematische cellen. Ze kunnen niet delen
omdat:
1. Totipotentie gaat verloren tijdens het differentiatieproces doordat de genetische
samenstelling verandert.
2. De genetische samenstelling blijft hetzelfde maar een groot deel ervan wordt
geblokkeerd. De blokkering kan worden opgeheven in de juiste omstandigheden en de
cellen zijn dus in principe nog totipotent
Schleiden en Schwann hebben als theorie dat de cel de basiseenheid is van het leven en
kiezen dus voor de tweede theorie, maar konden dit alleen theoretisch onderbouwen.
Haberlandt heeft het experimenteel geprobeerd te bewijzen door gebruik te maken van
embryozakvloeistof waarin een bevruchte eicel zich kon ontwikkelen. Zijn experimenten zijn
om verschillende redenen niet gelukt.
§3. Groeiregulatoren
Groeiregulatoren zijn stoffen die groei in de plant kunnen stimuleren. Hieronder vallen
planthormonen en synthetische (niet-natuurlijke) stoffen. De ontwikkeling van planten is de
realisatie van een ingebouwd genetisch programma, en is ook afhankelijk van externe
factoren. In weefselkweek kunnen de factoren beïnvloed worden, ook de groeiregulatoren.
Er zijn 5 groepen groeiregulatoren:
- Auxinen: groei naar licht
- Cytokininen: stimulatie celdeling
- Gibberellinen: lengtegroei
- Abscisinezuur: stressreactie
- Ethyleen: zaadkieming
Hoofdstuk 2. Factoren van invloed op in vitro cultuur
§2. Medium
- Water is het hoofdbestanddeel van alle media
- Minerale zouten
o Macrozouten: heeft de plant veel van nodig
o Microzouten: heeft de plant minder van nodig
- Agar wordt gebruikt bij vaste media, er zijn veel soorten van
- Er moet een koolstofbron aanwezig zijn omdat fotosynthese niet goed werkt in vitro.
Denk hierbij aan sucrose, glucose en fructose
- Vitaminen kunnen planten vaak zelf maken (bij voldoende N), maar soms moet het
worden toegevoegd
- Hormonen zoals cytokininen en auxinen kunnen worden toegevoegd
- Andere organische stoffen worden soms toegevoegd
- Kokosmelk kan worden toegevoegd
- Actieve kool kan zorgen voor verdonkering van het medium waardoor de wortels beter
groeien bijvoorbeeld, maar kan ook zorgen voor negatieve effecten
- Antibiotica en systemische fungiciden kunnen worden toegevoegd om bacteriegroei te
voorkomen of verminderen
§3. Explantaat
Explantaat: een stukje weefsel of een gedeelte van een orgaan dat verwijderd is van een
plant met het doel er een cultuur mee te beginnen. Er zijn een aantal dingen belangrijk aan
het explantaat:
- Grootte: hoe groter het explantaat, hoe groter de kans op orgaan of callus-vorming.
(Callus zijn totipotente cellen). Echter bij embryocultuur of meristeemculuur moeten
juist kleinere explantaten gebruikt worden voor een grotere kans op ziektevrije planten
, - Positie: veel cellen zijn in principe totipotent maar kunnen slecht of niet embryo’s
vormen. Er moeten dus cellen worden gebruikt die hier wel toe in staat kunnen en
daarvoor moet gekeken worden naar de positie van he explantaat in de plant
- Fysiologische ouderdom: jonger weefsel heeft over het algemeen een groter
morfogenetisch vermogen dan ouder weefsel.
- Genotype: hier is weinig onderzoek naar gedaan, maar het lijkt belangrijk te zijn.
Binnen een soort zijn sommige cultivars gemakkelijk, en andere juist moeilijk te
vermeerderen.
- Polariteit: de oriëntatie van het explantaat in het medium vergeleken met de oriëntatie
in de plant, kan van invloed zijn op de organogenese. Bij sommige planten wordt de
bolbodem boven het medium geplaatst (dus apolair geënt) en bevordert daarmee de
organogenese. Dit komt door:
o Betere zuurstofvoorziening boven het medium
o Minder last van remmende stoffen die in het medium diffunderen
o Andere hormoongradiënten in het weefsel
- Subculturen: een medium kan uitgeput raken of een cultuur kan een buis uitgroeien. Er
met daarom overgeënt worden. Dit kan zorgen voor:
o Verlies van morfogenetisch vermogen: als er vaak over wordt geënt, verliezen
lang bewaarde wortelculturen hun morfogenetisch vermogen. Dit kan zorgen
voor
Het vergaan van georganiseerde centra die zorgen voor celdeling
Verlies door afname van hormoonniveaus
Chromosoomabnormaliteiten waardoor ontwikkelingsprocessen geremd
kunnen worden.
o Toename van variatie: herhaaldelijk overenten leidt tot een groter aantal
fenotypische veranderingen zoals afwijkende bladeren of dwerggroei. Dit kan
komen door:
Segregatie van chimaeren (= mengsel van twee soorten, dus twee
plantensoorten die met elkaar gaan groeien)
Veranderingen in chromosoomaantal of -structuur
Genmutaties
Terugkeer naar juveniel stadium
Niet overerfbare fysiologische adapties
§4. Licht
Licht is niet super belangrijk bij in vitro cultuur omdat de meeste planten geen fotosynthese
kunnen doen. Toch kan het soms wel een positief effect hebben op organogenese. Aspecten
die van invloed kunnen zijn, zijn:
- Fotoperiode: de tijd waarin een cultuur gedurende een etmaal wordt blootgesteld aan
licht. De optimale fotoperiode is afhankelijk van de soort. Vaak wordt er in vitro kweek
niet veel gedaan met de fotoperiode
- Golflengte van het licht: organogenese is vaak het best bij 660 nm. Er zijn echter
uitzonderingen
- Lichtintensiteit: voor organogenese is de optimumintensiteit 1000 lux. Als de plant naar
in vivo gaat, heeft hij een hogere lichtsterkte nodig van 3000 tot 10000 lux.
§5. Temperatuur
De meeste culturen hebben een optimumtemperatuur van tussen de 24 en 28 graden Celsius.
Het in vitro optimum komt vaak overeen met het in vivo optimum. Houtige gewassen hebben
vaak een koude behandeling nodig om de winter na te bootsen. Sommige zaden hebben
kou nodig om uit kiemrust te komen. Voor specifieke morfogenetische gebeurtenissen kan
ook kou nodig zijn. Er kan ook een verschil tussen dag- en nachttemperatuur nodig zijn.
§6. Gasfase
De samenstelling van de gasfase (het gebied in de buis boen het medium), kan van belang
zijn voor de ontwikkeling van de cultuur. Ethyleen werkt remmend op morfogenese en
stimulerend op callusvorming. Ethyleen wordt afgegeven door het explantaat en de agar. Als
de buis gesloten is kan het ethyleen niet ontsnappen en is er dus meer van aanwezig. Dit kan
ook zorgen voor hyperhydricity (Planten nemen te veel water op en worden glazig. Ze gaan
, vaak dood als ze gaan bewortelen, zie H7). Naast ethyleen, kunnen ook koolstofdioxide,
ethanol en acetaldehyde zich opstapelen in gesloten buizen.
§7. Seizoensinvloeden
In het voorjaar is er minder auxine en cytokinine nodig dan in het najaar.
Hoofdstuk 3. In vitro vermeerderen
§1. Wanneer is het zinvol?
Vegetatieve vermeerdering in vitro is zinvol:
- Als snel veel planten wil krijgen
- Bij planten virusvrij gemakt zijn
- Bij planten die niet op een andere wijze kunnen groeien
o Steriele planten
o Niet-kiemende zaden
- Economisch gunstig
Vegetatieve vermeerdering in vitro is zinvol omdat:
- Het hele jaar door plantenmateriaal kan worden geproduceerd
- Geen dure kasruimte en verzorging
- Fytosanitair verantwoord transport: (H5.2)
o Er worden geen ziektekiemen verspreid
o Er wordt geen grond mee-getransporteerd
Voorwaarden voor succesvolle in vitro vermeerdering zijn:
- Strenge selectie van het uitgangsmateriaal
- Genetische stabiliteit
- Regeneratievermogen mag niet verloren gaan
- De overgang van kweekbuis naar grond mag niet te veel moeilijkheden opleveren
- De gebruikte groeiregulatoren mogen later in de teelt geen nadelige effecten
veroorzaken
§2. Het proces
Fase 0: Voorbehandeling onder hygiënische condities
Gezond uitgangsmateriaal moet worden geselecteerd. Alles moet worden klaargezet, zoals
kastemperatuur, watersysteem, luchtvochtigheid, belichting, etc.
Fase I: Het realiseren van een steriele cultuur
Na ontsmetting met chloorwater, worden explantaten uit de plant gesneden en in vitro
gebracht.
Fase II: Vermeerdering
Het plantenmateriaal vermeerdert. Hierna kan plantmateriaal uit de buis worden gehaald en
opgedeeld in meerdere buizen. De efficiëntie van fase II kan worden uitgedrukt in de
vermeerderingsfactor. Elke keer dat deze fase plaatsvindt wordt een cyclus genoemd.
Fase III: Beworteling
Na een aantal cycli worden de geproduceerde schuitjes op een ander type medium overgezet,
om ze in een conditie te brengen dat ze de overgang naar grond kunnen overleven. Hiervoor
moeten ze uitgroeien tot levenskrachtige afmetingen en moeten er wortels worden
geïnduceerd.
Fase IV: Afharden
De bewortelde plantjes worden in niet-steriele omstandigheden uitgeplant en krijgen
bijzondere zorg. Ze staan nog wel in de kas want ze kunnen de buitenwereld nog niet aan.
Bewortelen in vivo kan de voorkeur krijgen omdat:
§2. Totipotentie
Meristematische cellen produceren stengels, wortels en geslachtscellen. Ze zijn totipotent
Somatische cellen kunnen specifieke functies vervullen in het orgaan waar ze in voorkomen
en kunnen niet dele. Ze zijn afkomstig van meristematische cellen. Ze kunnen niet delen
omdat:
1. Totipotentie gaat verloren tijdens het differentiatieproces doordat de genetische
samenstelling verandert.
2. De genetische samenstelling blijft hetzelfde maar een groot deel ervan wordt
geblokkeerd. De blokkering kan worden opgeheven in de juiste omstandigheden en de
cellen zijn dus in principe nog totipotent
Schleiden en Schwann hebben als theorie dat de cel de basiseenheid is van het leven en
kiezen dus voor de tweede theorie, maar konden dit alleen theoretisch onderbouwen.
Haberlandt heeft het experimenteel geprobeerd te bewijzen door gebruik te maken van
embryozakvloeistof waarin een bevruchte eicel zich kon ontwikkelen. Zijn experimenten zijn
om verschillende redenen niet gelukt.
§3. Groeiregulatoren
Groeiregulatoren zijn stoffen die groei in de plant kunnen stimuleren. Hieronder vallen
planthormonen en synthetische (niet-natuurlijke) stoffen. De ontwikkeling van planten is de
realisatie van een ingebouwd genetisch programma, en is ook afhankelijk van externe
factoren. In weefselkweek kunnen de factoren beïnvloed worden, ook de groeiregulatoren.
Er zijn 5 groepen groeiregulatoren:
- Auxinen: groei naar licht
- Cytokininen: stimulatie celdeling
- Gibberellinen: lengtegroei
- Abscisinezuur: stressreactie
- Ethyleen: zaadkieming
Hoofdstuk 2. Factoren van invloed op in vitro cultuur
§2. Medium
- Water is het hoofdbestanddeel van alle media
- Minerale zouten
o Macrozouten: heeft de plant veel van nodig
o Microzouten: heeft de plant minder van nodig
- Agar wordt gebruikt bij vaste media, er zijn veel soorten van
- Er moet een koolstofbron aanwezig zijn omdat fotosynthese niet goed werkt in vitro.
Denk hierbij aan sucrose, glucose en fructose
- Vitaminen kunnen planten vaak zelf maken (bij voldoende N), maar soms moet het
worden toegevoegd
- Hormonen zoals cytokininen en auxinen kunnen worden toegevoegd
- Andere organische stoffen worden soms toegevoegd
- Kokosmelk kan worden toegevoegd
- Actieve kool kan zorgen voor verdonkering van het medium waardoor de wortels beter
groeien bijvoorbeeld, maar kan ook zorgen voor negatieve effecten
- Antibiotica en systemische fungiciden kunnen worden toegevoegd om bacteriegroei te
voorkomen of verminderen
§3. Explantaat
Explantaat: een stukje weefsel of een gedeelte van een orgaan dat verwijderd is van een
plant met het doel er een cultuur mee te beginnen. Er zijn een aantal dingen belangrijk aan
het explantaat:
- Grootte: hoe groter het explantaat, hoe groter de kans op orgaan of callus-vorming.
(Callus zijn totipotente cellen). Echter bij embryocultuur of meristeemculuur moeten
juist kleinere explantaten gebruikt worden voor een grotere kans op ziektevrije planten
, - Positie: veel cellen zijn in principe totipotent maar kunnen slecht of niet embryo’s
vormen. Er moeten dus cellen worden gebruikt die hier wel toe in staat kunnen en
daarvoor moet gekeken worden naar de positie van he explantaat in de plant
- Fysiologische ouderdom: jonger weefsel heeft over het algemeen een groter
morfogenetisch vermogen dan ouder weefsel.
- Genotype: hier is weinig onderzoek naar gedaan, maar het lijkt belangrijk te zijn.
Binnen een soort zijn sommige cultivars gemakkelijk, en andere juist moeilijk te
vermeerderen.
- Polariteit: de oriëntatie van het explantaat in het medium vergeleken met de oriëntatie
in de plant, kan van invloed zijn op de organogenese. Bij sommige planten wordt de
bolbodem boven het medium geplaatst (dus apolair geënt) en bevordert daarmee de
organogenese. Dit komt door:
o Betere zuurstofvoorziening boven het medium
o Minder last van remmende stoffen die in het medium diffunderen
o Andere hormoongradiënten in het weefsel
- Subculturen: een medium kan uitgeput raken of een cultuur kan een buis uitgroeien. Er
met daarom overgeënt worden. Dit kan zorgen voor:
o Verlies van morfogenetisch vermogen: als er vaak over wordt geënt, verliezen
lang bewaarde wortelculturen hun morfogenetisch vermogen. Dit kan zorgen
voor
Het vergaan van georganiseerde centra die zorgen voor celdeling
Verlies door afname van hormoonniveaus
Chromosoomabnormaliteiten waardoor ontwikkelingsprocessen geremd
kunnen worden.
o Toename van variatie: herhaaldelijk overenten leidt tot een groter aantal
fenotypische veranderingen zoals afwijkende bladeren of dwerggroei. Dit kan
komen door:
Segregatie van chimaeren (= mengsel van twee soorten, dus twee
plantensoorten die met elkaar gaan groeien)
Veranderingen in chromosoomaantal of -structuur
Genmutaties
Terugkeer naar juveniel stadium
Niet overerfbare fysiologische adapties
§4. Licht
Licht is niet super belangrijk bij in vitro cultuur omdat de meeste planten geen fotosynthese
kunnen doen. Toch kan het soms wel een positief effect hebben op organogenese. Aspecten
die van invloed kunnen zijn, zijn:
- Fotoperiode: de tijd waarin een cultuur gedurende een etmaal wordt blootgesteld aan
licht. De optimale fotoperiode is afhankelijk van de soort. Vaak wordt er in vitro kweek
niet veel gedaan met de fotoperiode
- Golflengte van het licht: organogenese is vaak het best bij 660 nm. Er zijn echter
uitzonderingen
- Lichtintensiteit: voor organogenese is de optimumintensiteit 1000 lux. Als de plant naar
in vivo gaat, heeft hij een hogere lichtsterkte nodig van 3000 tot 10000 lux.
§5. Temperatuur
De meeste culturen hebben een optimumtemperatuur van tussen de 24 en 28 graden Celsius.
Het in vitro optimum komt vaak overeen met het in vivo optimum. Houtige gewassen hebben
vaak een koude behandeling nodig om de winter na te bootsen. Sommige zaden hebben
kou nodig om uit kiemrust te komen. Voor specifieke morfogenetische gebeurtenissen kan
ook kou nodig zijn. Er kan ook een verschil tussen dag- en nachttemperatuur nodig zijn.
§6. Gasfase
De samenstelling van de gasfase (het gebied in de buis boen het medium), kan van belang
zijn voor de ontwikkeling van de cultuur. Ethyleen werkt remmend op morfogenese en
stimulerend op callusvorming. Ethyleen wordt afgegeven door het explantaat en de agar. Als
de buis gesloten is kan het ethyleen niet ontsnappen en is er dus meer van aanwezig. Dit kan
ook zorgen voor hyperhydricity (Planten nemen te veel water op en worden glazig. Ze gaan
, vaak dood als ze gaan bewortelen, zie H7). Naast ethyleen, kunnen ook koolstofdioxide,
ethanol en acetaldehyde zich opstapelen in gesloten buizen.
§7. Seizoensinvloeden
In het voorjaar is er minder auxine en cytokinine nodig dan in het najaar.
Hoofdstuk 3. In vitro vermeerderen
§1. Wanneer is het zinvol?
Vegetatieve vermeerdering in vitro is zinvol:
- Als snel veel planten wil krijgen
- Bij planten virusvrij gemakt zijn
- Bij planten die niet op een andere wijze kunnen groeien
o Steriele planten
o Niet-kiemende zaden
- Economisch gunstig
Vegetatieve vermeerdering in vitro is zinvol omdat:
- Het hele jaar door plantenmateriaal kan worden geproduceerd
- Geen dure kasruimte en verzorging
- Fytosanitair verantwoord transport: (H5.2)
o Er worden geen ziektekiemen verspreid
o Er wordt geen grond mee-getransporteerd
Voorwaarden voor succesvolle in vitro vermeerdering zijn:
- Strenge selectie van het uitgangsmateriaal
- Genetische stabiliteit
- Regeneratievermogen mag niet verloren gaan
- De overgang van kweekbuis naar grond mag niet te veel moeilijkheden opleveren
- De gebruikte groeiregulatoren mogen later in de teelt geen nadelige effecten
veroorzaken
§2. Het proces
Fase 0: Voorbehandeling onder hygiënische condities
Gezond uitgangsmateriaal moet worden geselecteerd. Alles moet worden klaargezet, zoals
kastemperatuur, watersysteem, luchtvochtigheid, belichting, etc.
Fase I: Het realiseren van een steriele cultuur
Na ontsmetting met chloorwater, worden explantaten uit de plant gesneden en in vitro
gebracht.
Fase II: Vermeerdering
Het plantenmateriaal vermeerdert. Hierna kan plantmateriaal uit de buis worden gehaald en
opgedeeld in meerdere buizen. De efficiëntie van fase II kan worden uitgedrukt in de
vermeerderingsfactor. Elke keer dat deze fase plaatsvindt wordt een cyclus genoemd.
Fase III: Beworteling
Na een aantal cycli worden de geproduceerde schuitjes op een ander type medium overgezet,
om ze in een conditie te brengen dat ze de overgang naar grond kunnen overleven. Hiervoor
moeten ze uitgroeien tot levenskrachtige afmetingen en moeten er wortels worden
geïnduceerd.
Fase IV: Afharden
De bewortelde plantjes worden in niet-steriele omstandigheden uitgeplant en krijgen
bijzondere zorg. Ze staan nog wel in de kas want ze kunnen de buitenwereld nog niet aan.
Bewortelen in vivo kan de voorkeur krijgen omdat:
