PRACTICUM ENZYMOLOGIE
Maaren De Houwer en Laura Dries
Doel:
Er wordt onderzoek gedaan naar inhibitoren. De inhibitor wordt bepaald (competitief of niet competitief) door
reactiesnelheden te vergelijken zonder en met inhibitor.
Eerst werd de bepaling van de maximale reactiesnelheden (Vmax) bij een continue en discontinue meting uitgevoerd,
de reactiesnelheidsconstante (k3) in functie van de enzymconcentratie ([E] in U/L) of de substraatconcentratie ([S] in
mM) bepalen. Het bepalen van de Michaëlis-Menten constante (KM) bij kamertemperatuur en bij constante pH-
waarde. Dit met behulp van spectrofotometrie (kinetisch programma).
Reacties:
- Reactie 1: vorming p-NA en Benzoyl-arginine door toevoeging van trypsine aan BAPNA
- Reactie 2: vorming p-NF en p-nitrofenolaat door toevoeging zure fosfatase bij pNPP
,Principe:
Analysemethode: spectrofotometrie met kinetisch programma
Bepalingsmethode: -standaardijklijn methode
-Hanes Woolf transformatie
Formules:
- Wet van Lambert-Beer: ! = $ % & % ' met: E = extinctie
e = molaire extinctiecoëfficiënt (L/mol.cm)
l = weglengte (cm)
C = concentratie oplossing (mM of U/L)
$
- (!"# = %&'(
met: Vmax = maximale reactiesnelheid (mol/L.min)
rico = richtingscoëfficiënt
∆*/!&,
- )= met: v = reactiesnelheid (mol/L.min)
-
ΔE/min = richtingscoëfficiënt
Ɛ= molaire extinctiecoëfficiënt (L/mol.cm)
/
- ). = [*]
met: v’ = reactiesnelheid’ (mmol/min.U)
V = reactiesnelheid (mol/L.min)
[E] = concentratie gebruikte enzym (U/L)
"
- *2 = 3 met: KM = Michaëlis-Menten constante (mM)
a = richtingscoëfficiënt
b = intercept met y-as
[4] [4].
- = met: v’ =
5. 5.
reactiesnelheid’ (mmol/min.U)
[S]’ = verdunde
substraatconcentratie (mM)
[7]
- +6 = ! met: Ki = dissociatieconstante inhibitor (mM)
8 " 9
!#$
[I] = concentratie inhibitor (mM
bi = intercept y-as van geïnhibeerd reactie
b = intercept y-as van niet-geïnhibeerde reactie
MEETRESULTATEN, GRAFIEKEN EN INTERPRETATIES:
BEPALING VAN DE MOLAIRE ECTINCTIECOËFFICIËNTEN VAN P-NF EN P-NA
De molaire extinctiecoëffieciënten van P-NF en P-NA werden bepaald omdat deze nadien nodig zijn voor
het bepalen van de reactiesnelheid van het enzym trypsine. De extinctiemetingen van een
verdunningsreeks van P-NA en P-NF werden hiervoor gemeten en uitgezet in functie van de concentratie
van het substraat. Aan de hand van de wet van Lambert-Beer kan op deze manier de extinctiecoëfficiënt
vastgesteld worden door de richtingscoëfficiënt van de ijklijn te bepalen.
, De molaire extinctiecoëfficiënt Ꜫ van p-NF is gelijk aan 45,75 L. mmol-1. cm-1.
De molaire extinctiecoëfficiënt Ꜫ van p-NA is gelijk aan 7,5141 L. mmol-1. cm-1.
De extinctiemetingen bevatten bij beide experimenten geen outliers. Wel is het belangrijk te vermelden
dat het experiment van de extinctiecoëfficiënt van P-NF weinig betrouwbaar is door de lage R2.
P-NF
Tabel 1: Extinctiemetingen van p-NF en outliers gemeten bij 410nm met de bijhorende concentratie in mmol/L voor de 10 verschillende
cuvetten. Outliers van de gemeten extincties van P-NF
Grafiek 1: De extinctie in functie van de concentratie van p-NF gemeten bij 410nm op kamertemperatuur met een ph van 5,6
Tabel 3:
Maaren De Houwer en Laura Dries
Doel:
Er wordt onderzoek gedaan naar inhibitoren. De inhibitor wordt bepaald (competitief of niet competitief) door
reactiesnelheden te vergelijken zonder en met inhibitor.
Eerst werd de bepaling van de maximale reactiesnelheden (Vmax) bij een continue en discontinue meting uitgevoerd,
de reactiesnelheidsconstante (k3) in functie van de enzymconcentratie ([E] in U/L) of de substraatconcentratie ([S] in
mM) bepalen. Het bepalen van de Michaëlis-Menten constante (KM) bij kamertemperatuur en bij constante pH-
waarde. Dit met behulp van spectrofotometrie (kinetisch programma).
Reacties:
- Reactie 1: vorming p-NA en Benzoyl-arginine door toevoeging van trypsine aan BAPNA
- Reactie 2: vorming p-NF en p-nitrofenolaat door toevoeging zure fosfatase bij pNPP
,Principe:
Analysemethode: spectrofotometrie met kinetisch programma
Bepalingsmethode: -standaardijklijn methode
-Hanes Woolf transformatie
Formules:
- Wet van Lambert-Beer: ! = $ % & % ' met: E = extinctie
e = molaire extinctiecoëfficiënt (L/mol.cm)
l = weglengte (cm)
C = concentratie oplossing (mM of U/L)
$
- (!"# = %&'(
met: Vmax = maximale reactiesnelheid (mol/L.min)
rico = richtingscoëfficiënt
∆*/!&,
- )= met: v = reactiesnelheid (mol/L.min)
-
ΔE/min = richtingscoëfficiënt
Ɛ= molaire extinctiecoëfficiënt (L/mol.cm)
/
- ). = [*]
met: v’ = reactiesnelheid’ (mmol/min.U)
V = reactiesnelheid (mol/L.min)
[E] = concentratie gebruikte enzym (U/L)
"
- *2 = 3 met: KM = Michaëlis-Menten constante (mM)
a = richtingscoëfficiënt
b = intercept met y-as
[4] [4].
- = met: v’ =
5. 5.
reactiesnelheid’ (mmol/min.U)
[S]’ = verdunde
substraatconcentratie (mM)
[7]
- +6 = ! met: Ki = dissociatieconstante inhibitor (mM)
8 " 9
!#$
[I] = concentratie inhibitor (mM
bi = intercept y-as van geïnhibeerd reactie
b = intercept y-as van niet-geïnhibeerde reactie
MEETRESULTATEN, GRAFIEKEN EN INTERPRETATIES:
BEPALING VAN DE MOLAIRE ECTINCTIECOËFFICIËNTEN VAN P-NF EN P-NA
De molaire extinctiecoëffieciënten van P-NF en P-NA werden bepaald omdat deze nadien nodig zijn voor
het bepalen van de reactiesnelheid van het enzym trypsine. De extinctiemetingen van een
verdunningsreeks van P-NA en P-NF werden hiervoor gemeten en uitgezet in functie van de concentratie
van het substraat. Aan de hand van de wet van Lambert-Beer kan op deze manier de extinctiecoëfficiënt
vastgesteld worden door de richtingscoëfficiënt van de ijklijn te bepalen.
, De molaire extinctiecoëfficiënt Ꜫ van p-NF is gelijk aan 45,75 L. mmol-1. cm-1.
De molaire extinctiecoëfficiënt Ꜫ van p-NA is gelijk aan 7,5141 L. mmol-1. cm-1.
De extinctiemetingen bevatten bij beide experimenten geen outliers. Wel is het belangrijk te vermelden
dat het experiment van de extinctiecoëfficiënt van P-NF weinig betrouwbaar is door de lage R2.
P-NF
Tabel 1: Extinctiemetingen van p-NF en outliers gemeten bij 410nm met de bijhorende concentratie in mmol/L voor de 10 verschillende
cuvetten. Outliers van de gemeten extincties van P-NF
Grafiek 1: De extinctie in functie van de concentratie van p-NF gemeten bij 410nm op kamertemperatuur met een ph van 5,6
Tabel 3:
