Genetica Examenvragen Hoofdstuk 4
,
,Bij een zaak van vermeende sluikslachting wordt een partij rundvlees in beslag
genomen. Op hetzelfde bedrijf wordt tevens het hoofd van een rund gevonden. Indien
kan bewezen worden dat het vlees en het hoofd van hetzelfde dier afkomstig zijn is de
sluikslachting aangetoond. Beschrijf in detail de moleculair genetische techniek
waarmee u dit probleem zou aanpakken.
Ik zou gebruik maken van het vergelijken van de lengte van de microsatellieten van beide
stalen.
1. Als eerste zal ik een staal van het rundvlees en van de kop nemen.
2. Het DNA uit deze cellen(rundsvlees en kopvlees apart) moet er eerst uit gehaald
worden:
a. Door toevoegen van SDS (sodium dodecyl sulfaat) breekt de celwand.
b. Door toevoeging van EDTA (proteine kinase K), worden de eiwitten kapot gemaakt
door proteine kinase K.
c. Na het doen van een fenol extractie zijn de eiwitten na centrifugeren naar de bodem
gezakt en worden ze verwijderd. (DNA blijft in waterige fase)
d. Het RNA wordt afgebroken via RNase
e. Je hebt nu alleen het DNA
3. Het DNA moet gefragmenteerd worden door verschillende primers die specifiek zijn voor
de microsattelieten die je wilt vergelijken. Dit gebeurt aan de hand van PCR.
a. In een vat zit nu het DNA. Hierbij voeg je deoxynucleotiden, een aantal specifieke
primers en taq polymerase toe (polymerase dat bij hoge temp kan werken =
theromostabiel polymerase)
b. Het DNA laat je op 94 graden denatureren, er zijn nu 2 enkelstrengige DNA
strengen gevormd.
c. Daarna wordt de temperatuur gedaalt naar 50-65 graden afhankelijk van wat voor
primers je gebruikt. De primer gaan nu op de plaatsen zitten die de
microsatellieten flankeren. (upper en lower primer) = anealing
, d. Nu wordt de temperatuur opgedreven naar 72 graden. Taq polymerase gaat vanaf
de primers de deoxynucleotide inbouwen van 5’ naar 3’.= polymerisatie
e. Als men nog een cyclus doet hebben we de fragmenten die we nodig hebben.
We doen daarna nog een paar keer (20-30x) de cyclus om genoeg DNA
materiaal te verkrijgen
4. Nu we de fragmenten hebben gaan we ze scheiden door PAGE (polyacrylamide gel
electroforese). Deze techniek heeft als voordeel dat het een resolutie van 1 bp heeft en
dus deze fragmenten van elkaar kan scheiden.
a. Je doet de fragmenten in een hokje van je PAGE
b. Je zet stroom over deze gel. Aan de bovenkant zit een negatieve lading (de
kathode) en onderaan de positieve lading. Na het aanzetten van stroom zullen
de negatieve DNA fragmenten migrergen door de gel. grote fragmenten
migreren minder ver dan kleine.
5. (Om de fragmenten zichtbaar te maken kan het worden overgezet op een nylon membraan
dmv southern blotting. Na dit gedaan te hebben wordt dit membraan behaldeld met
radioactief gelabelde DNA sondes.) (of behandelen met EtBr) Nu kunnen we de
fingerprint zien. Dit doen we voor het rundsvlees en de rundskop apart, en zetten dit langs
elkaar. Nu kunnen we zien of de microsattelieten overeen komen of niet. Komen ze
overeen is het rundsvlees van de kop.
,
,Bij een zaak van vermeende sluikslachting wordt een partij rundvlees in beslag
genomen. Op hetzelfde bedrijf wordt tevens het hoofd van een rund gevonden. Indien
kan bewezen worden dat het vlees en het hoofd van hetzelfde dier afkomstig zijn is de
sluikslachting aangetoond. Beschrijf in detail de moleculair genetische techniek
waarmee u dit probleem zou aanpakken.
Ik zou gebruik maken van het vergelijken van de lengte van de microsatellieten van beide
stalen.
1. Als eerste zal ik een staal van het rundvlees en van de kop nemen.
2. Het DNA uit deze cellen(rundsvlees en kopvlees apart) moet er eerst uit gehaald
worden:
a. Door toevoegen van SDS (sodium dodecyl sulfaat) breekt de celwand.
b. Door toevoeging van EDTA (proteine kinase K), worden de eiwitten kapot gemaakt
door proteine kinase K.
c. Na het doen van een fenol extractie zijn de eiwitten na centrifugeren naar de bodem
gezakt en worden ze verwijderd. (DNA blijft in waterige fase)
d. Het RNA wordt afgebroken via RNase
e. Je hebt nu alleen het DNA
3. Het DNA moet gefragmenteerd worden door verschillende primers die specifiek zijn voor
de microsattelieten die je wilt vergelijken. Dit gebeurt aan de hand van PCR.
a. In een vat zit nu het DNA. Hierbij voeg je deoxynucleotiden, een aantal specifieke
primers en taq polymerase toe (polymerase dat bij hoge temp kan werken =
theromostabiel polymerase)
b. Het DNA laat je op 94 graden denatureren, er zijn nu 2 enkelstrengige DNA
strengen gevormd.
c. Daarna wordt de temperatuur gedaalt naar 50-65 graden afhankelijk van wat voor
primers je gebruikt. De primer gaan nu op de plaatsen zitten die de
microsatellieten flankeren. (upper en lower primer) = anealing
, d. Nu wordt de temperatuur opgedreven naar 72 graden. Taq polymerase gaat vanaf
de primers de deoxynucleotide inbouwen van 5’ naar 3’.= polymerisatie
e. Als men nog een cyclus doet hebben we de fragmenten die we nodig hebben.
We doen daarna nog een paar keer (20-30x) de cyclus om genoeg DNA
materiaal te verkrijgen
4. Nu we de fragmenten hebben gaan we ze scheiden door PAGE (polyacrylamide gel
electroforese). Deze techniek heeft als voordeel dat het een resolutie van 1 bp heeft en
dus deze fragmenten van elkaar kan scheiden.
a. Je doet de fragmenten in een hokje van je PAGE
b. Je zet stroom over deze gel. Aan de bovenkant zit een negatieve lading (de
kathode) en onderaan de positieve lading. Na het aanzetten van stroom zullen
de negatieve DNA fragmenten migrergen door de gel. grote fragmenten
migreren minder ver dan kleine.
5. (Om de fragmenten zichtbaar te maken kan het worden overgezet op een nylon membraan
dmv southern blotting. Na dit gedaan te hebben wordt dit membraan behaldeld met
radioactief gelabelde DNA sondes.) (of behandelen met EtBr) Nu kunnen we de
fingerprint zien. Dit doen we voor het rundsvlees en de rundskop apart, en zetten dit langs
elkaar. Nu kunnen we zien of de microsattelieten overeen komen of niet. Komen ze
overeen is het rundsvlees van de kop.
