Samenvatting moleculaire genetica
Inhoudsopgave
Introductie ................................................................................................................................................................................. 3
Herhaling .................................................................................................................................................................................... 3
DNA replicatie ................................................................................................................................................................................ 3
HC1 DNA mutaties en repair (H12) ............................................................................................................................................. 4
Types van DNA-mutaties ................................................................................................................................................................ 4
DNA alteraties die leiden tot mutaties ........................................................................................................................................... 5
DNA repairmechanismen ............................................................................................................................................................... 5
HC2 Recombinatie als herstelproces (H13) ................................................................................................................................. 8
Recombinatie als DNA repair proces .............................................................................................................................................. 8
Homologe recombinatie in eukaryoten .......................................................................................................................................... 9
Niet-homologe “end-joining” ......................................................................................................................................................... 9
HC3 Site-specifieke recombinatie en transpositie (H14) ........................................................................................................... 10
Inleiding ........................................................................................................................................................................................ 10
Site-specifieke recombinatie ........................................................................................................................................................ 10
Transpositie .................................................................................................................................................................................. 12
Wat is de evolutionaire link tussen transposons, retrotransposons en retrovirussen .................................................................. 14
HC4 Horizontale gentransfer (H11 Meneely) ............................................................................................................................ 15
Verschil tussen verticale en horizontale gentransfer ................................................................................................................... 15
Drie mechanismes van horizontale gentransfer ........................................................................................................................... 15
Barrières van een cel voor genetische recombinatie en implicaties voor evolutie ....................................................................... 18
HC5 Bio-informatica ................................................................................................................................................................. 20
HC7 Epigenetica (H10) .............................................................................................................................................................. 21
Nucleosomen ................................................................................................................................................................................ 21
Chromosoom structuur en organisatie ......................................................................................................................................... 22
Regulatie van chromosomen ........................................................................................................................................................ 22
HC8 DNA methylatie ................................................................................................................................................................. 25
DNA methylatie ............................................................................................................................................................................ 25
DNMT ........................................................................................................................................................................................... 25
DNA methylatie werking .............................................................................................................................................................. 26
Insulators en CTCF ........................................................................................................................................................................ 27
Bisulfide sequencing ..................................................................................................................................................................... 28
Transgenerationele epigenetica en imprinting ............................................................................................................................ 28
HC9 Technieken-genexpressie .................................................................................................................................................. 30
Herhaling transcriptie .................................................................................................................................................................. 30
RNA Processing: splicing .......................................................................................................................................................... 30
, Meten van genexpressie op transcriptie niveau ........................................................................................................................... 31
Lysis van de cel ........................................................................................................................................................................ 31
Purificatie van RNA .................................................................................................................................................................. 32
Zichtbaar maken/meten van RNA ........................................................................................................................................... 33
HC10 Regulatie algemeen ......................................................................................................................................................... 36
Regulatie transcriptie initiatie ...................................................................................................................................................... 36
Eukaryoot VS prokaryoot ............................................................................................................................................................. 38
Structurele basis van transcriptionele regulatie ........................................................................................................................... 38
HC11 Regulatie van genexpressie in prokaryoten ..................................................................................................................... 39
Transcriptionele regulatie ............................................................................................................................................................ 39
Riboswitches................................................................................................................................................................................. 41
rRNA ............................................................................................................................................................................................. 42
HC12 Regulatie van genexpressie in eukaryoten ...................................................................................................................... 43
Basismechanismen transcriptionele activatie .............................................................................................................................. 43
Combinatie controle ..................................................................................................................................................................... 44
Eukaryoo-specifieke regulatiemechanismen ............................................................................................................................... 45
HC13 Post-transcriptionele regulatie ........................................................................................................................................ 47
RNA editing .................................................................................................................................................................................. 47
RNA transport en degradatie ....................................................................................................................................................... 47
In nucleus ..................................................................................................................................................................................... 47
In cytoplasma ............................................................................................................................................................................... 48
Large scale regulation .................................................................................................................................................................. 49
RNA interferenties ........................................................................................................................................................................ 50
Genregulatie in de ontwikkeling .................................................................................................................................................. 50
HC14 Functie van een gen ........................................................................................................................................................ 53
Isolatie van genen voor onderzoek ............................................................................................................................................... 53
Werken met genen en hun producten .......................................................................................................................................... 55
Begrijpen van de genen en de producten hiervan ........................................................................................................................ 57
,Introductie
Examen ➔ hoe zou je het zelf doen/bestuderen…
Epigenetica ➔ schriftelijk
Rest ➔ mondeling
Herhaling
DNA replicatie
https://www.youtube.com/watch?v=TNKWgcFPHqw&t=40s
Helicase doet het DNA open en vormt een replicatievork, primase start het proces en maakt primers en zet
ze erop, DNA polymerase bindt aan de primers en zal de replicatie doen van 5’ naar 3’
• Leading strand wordt continu gemaakt
• Lagging strand wordt in okazakifragmenten gemaakt
Exonuclease verwijdert alle primers, DNA polymerase vult die op, DNA ligase lijmt het DNA toe en vormt
dsDNA
,HC1 DNA mutaties en repair (H12)
Inleiding zie boek
Types van DNA-mutaties
• Mutatie = verandering in DNA-sequentie
o 1/enkele basenparen ➔ fout in replicatie
o Grotere fragmenten ➔ chromosomale herschikkingen
• Puntmutatie ➔ enkel basenpaar
o Transitie (C=G wordt T=A) (meest voorkomend)
o Transversie (C=G wordt G=C of A=T)
• Stille mutatie
o GAA wordt GAG maar het blijft een codon voor
glutamaat
• Missense mutatie
o Wordt een ander aminozuur
• Nonsense mutatie
o Wordt een stopcodon
Puntmutaties in 2 stappen:
• Foute nucleotide wordt erin gezet
• Mismatch wordt niet hersteld ➔ wordt beschouwd als juist en
wordt niet meer gedetecteerd als fout
In coderende regio (70% negatief effect)
In niet coderende regio (< 7% negatief effect)
Voorbeelden:
Sikkelcelanemie
TSG – oncogenen (kan functie bijkrijgen of verliezen)
InDels:
• Insertie = toevoegen van 1/meer baseparen
• Deletie = verwijderen van 1/meer baseparen
• Veroorzaakt door
o Foute recombinatie
o Template slippage
• Frameshift mutatie:
o Indel van 1/2 baseparen ➔ codons niet meer hetzelfde
o Functie van proteïne is hierdoor vaak weg
• Indel van 3 baseparen ➔ template slippage
o Triplet expansion diseases: Huntington,
Fragiel X-syndroom, …
Chromosoom aberraties (grotere fragmenten):
,DNA alteraties die leiden tot mutaties
• Reactive chemicals
• Hydrolyse reacties
• Electrofiele aanval door alkylering en reactieve zuurstof soorten
• Radiation: x-rays, UV, …
Hydrolyse = splitsen van een molecule door toevoeging van H2O:
• Deaminatie = verwijderen van aminogroep
o Deaminatie cytosine ➔ uracil
• Depurinatie = aanval van water op N-B-glycosyl band tussen base
& pentose ➔ breekt die band
o Hierdoor vormt de abasic site single-stranded DNA
Elektrofiele aanval door alkylating agents & reactive oxygen species:
• Cigaretten rook, industriele vervuiling, chemicalien & reactive oxygen generated inside cells
• Nitrous acid-induced deamination
o HNO2 reageert met A&C ➔ foute baseparen maken ➔ transitie mutatie
• Oxidative damage
o Oxidatie van de basen, desoxyribose suikers, verwijderen van basen,
strand breaks
o Veroorzaakt kanker
• Damage by alkylation
o Alkylgroep op bases/ruggengraad zetten = alkylering
o Geen effect tot het helemaal verhinderen van basepairing
o Carcinogenen ➔ veroorzaakt kanker (vb benzo(a)pyrene in
cigaretten)
DNA repairmechanismen
Mismatch repair (MMR)
• Alleen de nucleotide bases in de nieuwe streng worden vervangen
o Net na het passeren van de replicatievork is er een stukje van de nieuwe streng een korte
periode ongemethyleerd (bacteriën)
• Herkent korte lussen (<4 bp) door template slippage ➔ deletie/insertie
,Direct repair
Beschadigde nucleotiden:
• Cross-links
o Photolyase gebruikt lichtenergie om de UV damage te herstellen en dus ook de cross links
• Alkylatie & oxidatie
Base excision repair (BER)
• 1 beschadigde base
• Verschil tussen bacteriën en eukaryoten ➔
• UDG (=uracil DNA glycosylase):
o Scant de helix ➔ damaged base recognition
door het DNA te breken en in de actieve site
van het enzym te zetten
Nucleotide excision repair (NER)
• Grotere stukken
• NER & BER = enkelstrengige breuken
,Recombination repair
• Dubbelstrengige breuken
• Homologe recombinatie (adhv zusterchromatide)
• Non-homologe recombinatie (adhv deleties/inserties ➔ !!meer mutaties!!) (NHEJ)
Translesion synthesis repair
• Als er een fout zit bij de replicatievork
• TLS = translesion synthesis
o Heeft geen proofreading 3’ -> 5’ exonuclease
en kan de fout in het DNA negeren (vaak is het
niet coderende regio ➔ geen E verspillen aan
nutteloze dingen)
Proces Voorbeeld Belangrijke enzymen
MMR Mismatched bp opgenomen door polymerase MutS/L
BER Oxidatieve schade/gealkyleerde basen DNA glycosylases (UDG)
Photoreactivation Pyrimidine dimeren afkomstig van UV licht DNA photolyase
NER Grotere gealkyleerde basen; pyrimidine dimeren Exinuclease
Recombinatie repair DNA double-strand breaks RecA recombinase
Translesion synthesis Abasic sites; gealkyleerde basen; pyrimidine TLS Pol
dimeren
, HC2 Recombinatie als herstelproces (H13)
Recombinatie als DNA repair proces
• Recombinatie = uitwisselen van genetisch materiaal tijdens
replicatie tussen 2 chromosomen (zelfde/ander allel/gen)
• Breuk in 1 streng = veel minder erg dan breuk in beide strengen
o 1 streng breuk ➔ gerepareerd adhv sequentie van
andere streng (complementair)
o 2 streng breuk = moeilijker ➔ kijken naar homologe
chromosomen of stukje eruit laten
• Proces: Overhangs maken ➔ strand invasions vormen holiday
junctions ➔ strand extension ➔ SDSA/DSBR
o SDSA (= synthesis-dependent strand annealing)
▪ We laten los, iedereen gaat terug naar zen plaats en je hebt terug de originele streng
➔ wisseling van genetische informatie is mogelijk
o DSBR (= double-strand break repair)
▪ Niet gewoon loslaten en ligeren, maar ook doorknippen (x-/y-richting)
o Branch migration ➔ holiday junctions schuiven over chromosoom
▪ Fork regression ➔ andere nieuwe streng gebruiken als template
o Gap repair ➔ hele streng gebruiken voor herstel
Inhoudsopgave
Introductie ................................................................................................................................................................................. 3
Herhaling .................................................................................................................................................................................... 3
DNA replicatie ................................................................................................................................................................................ 3
HC1 DNA mutaties en repair (H12) ............................................................................................................................................. 4
Types van DNA-mutaties ................................................................................................................................................................ 4
DNA alteraties die leiden tot mutaties ........................................................................................................................................... 5
DNA repairmechanismen ............................................................................................................................................................... 5
HC2 Recombinatie als herstelproces (H13) ................................................................................................................................. 8
Recombinatie als DNA repair proces .............................................................................................................................................. 8
Homologe recombinatie in eukaryoten .......................................................................................................................................... 9
Niet-homologe “end-joining” ......................................................................................................................................................... 9
HC3 Site-specifieke recombinatie en transpositie (H14) ........................................................................................................... 10
Inleiding ........................................................................................................................................................................................ 10
Site-specifieke recombinatie ........................................................................................................................................................ 10
Transpositie .................................................................................................................................................................................. 12
Wat is de evolutionaire link tussen transposons, retrotransposons en retrovirussen .................................................................. 14
HC4 Horizontale gentransfer (H11 Meneely) ............................................................................................................................ 15
Verschil tussen verticale en horizontale gentransfer ................................................................................................................... 15
Drie mechanismes van horizontale gentransfer ........................................................................................................................... 15
Barrières van een cel voor genetische recombinatie en implicaties voor evolutie ....................................................................... 18
HC5 Bio-informatica ................................................................................................................................................................. 20
HC7 Epigenetica (H10) .............................................................................................................................................................. 21
Nucleosomen ................................................................................................................................................................................ 21
Chromosoom structuur en organisatie ......................................................................................................................................... 22
Regulatie van chromosomen ........................................................................................................................................................ 22
HC8 DNA methylatie ................................................................................................................................................................. 25
DNA methylatie ............................................................................................................................................................................ 25
DNMT ........................................................................................................................................................................................... 25
DNA methylatie werking .............................................................................................................................................................. 26
Insulators en CTCF ........................................................................................................................................................................ 27
Bisulfide sequencing ..................................................................................................................................................................... 28
Transgenerationele epigenetica en imprinting ............................................................................................................................ 28
HC9 Technieken-genexpressie .................................................................................................................................................. 30
Herhaling transcriptie .................................................................................................................................................................. 30
RNA Processing: splicing .......................................................................................................................................................... 30
, Meten van genexpressie op transcriptie niveau ........................................................................................................................... 31
Lysis van de cel ........................................................................................................................................................................ 31
Purificatie van RNA .................................................................................................................................................................. 32
Zichtbaar maken/meten van RNA ........................................................................................................................................... 33
HC10 Regulatie algemeen ......................................................................................................................................................... 36
Regulatie transcriptie initiatie ...................................................................................................................................................... 36
Eukaryoot VS prokaryoot ............................................................................................................................................................. 38
Structurele basis van transcriptionele regulatie ........................................................................................................................... 38
HC11 Regulatie van genexpressie in prokaryoten ..................................................................................................................... 39
Transcriptionele regulatie ............................................................................................................................................................ 39
Riboswitches................................................................................................................................................................................. 41
rRNA ............................................................................................................................................................................................. 42
HC12 Regulatie van genexpressie in eukaryoten ...................................................................................................................... 43
Basismechanismen transcriptionele activatie .............................................................................................................................. 43
Combinatie controle ..................................................................................................................................................................... 44
Eukaryoo-specifieke regulatiemechanismen ............................................................................................................................... 45
HC13 Post-transcriptionele regulatie ........................................................................................................................................ 47
RNA editing .................................................................................................................................................................................. 47
RNA transport en degradatie ....................................................................................................................................................... 47
In nucleus ..................................................................................................................................................................................... 47
In cytoplasma ............................................................................................................................................................................... 48
Large scale regulation .................................................................................................................................................................. 49
RNA interferenties ........................................................................................................................................................................ 50
Genregulatie in de ontwikkeling .................................................................................................................................................. 50
HC14 Functie van een gen ........................................................................................................................................................ 53
Isolatie van genen voor onderzoek ............................................................................................................................................... 53
Werken met genen en hun producten .......................................................................................................................................... 55
Begrijpen van de genen en de producten hiervan ........................................................................................................................ 57
,Introductie
Examen ➔ hoe zou je het zelf doen/bestuderen…
Epigenetica ➔ schriftelijk
Rest ➔ mondeling
Herhaling
DNA replicatie
https://www.youtube.com/watch?v=TNKWgcFPHqw&t=40s
Helicase doet het DNA open en vormt een replicatievork, primase start het proces en maakt primers en zet
ze erop, DNA polymerase bindt aan de primers en zal de replicatie doen van 5’ naar 3’
• Leading strand wordt continu gemaakt
• Lagging strand wordt in okazakifragmenten gemaakt
Exonuclease verwijdert alle primers, DNA polymerase vult die op, DNA ligase lijmt het DNA toe en vormt
dsDNA
,HC1 DNA mutaties en repair (H12)
Inleiding zie boek
Types van DNA-mutaties
• Mutatie = verandering in DNA-sequentie
o 1/enkele basenparen ➔ fout in replicatie
o Grotere fragmenten ➔ chromosomale herschikkingen
• Puntmutatie ➔ enkel basenpaar
o Transitie (C=G wordt T=A) (meest voorkomend)
o Transversie (C=G wordt G=C of A=T)
• Stille mutatie
o GAA wordt GAG maar het blijft een codon voor
glutamaat
• Missense mutatie
o Wordt een ander aminozuur
• Nonsense mutatie
o Wordt een stopcodon
Puntmutaties in 2 stappen:
• Foute nucleotide wordt erin gezet
• Mismatch wordt niet hersteld ➔ wordt beschouwd als juist en
wordt niet meer gedetecteerd als fout
In coderende regio (70% negatief effect)
In niet coderende regio (< 7% negatief effect)
Voorbeelden:
Sikkelcelanemie
TSG – oncogenen (kan functie bijkrijgen of verliezen)
InDels:
• Insertie = toevoegen van 1/meer baseparen
• Deletie = verwijderen van 1/meer baseparen
• Veroorzaakt door
o Foute recombinatie
o Template slippage
• Frameshift mutatie:
o Indel van 1/2 baseparen ➔ codons niet meer hetzelfde
o Functie van proteïne is hierdoor vaak weg
• Indel van 3 baseparen ➔ template slippage
o Triplet expansion diseases: Huntington,
Fragiel X-syndroom, …
Chromosoom aberraties (grotere fragmenten):
,DNA alteraties die leiden tot mutaties
• Reactive chemicals
• Hydrolyse reacties
• Electrofiele aanval door alkylering en reactieve zuurstof soorten
• Radiation: x-rays, UV, …
Hydrolyse = splitsen van een molecule door toevoeging van H2O:
• Deaminatie = verwijderen van aminogroep
o Deaminatie cytosine ➔ uracil
• Depurinatie = aanval van water op N-B-glycosyl band tussen base
& pentose ➔ breekt die band
o Hierdoor vormt de abasic site single-stranded DNA
Elektrofiele aanval door alkylating agents & reactive oxygen species:
• Cigaretten rook, industriele vervuiling, chemicalien & reactive oxygen generated inside cells
• Nitrous acid-induced deamination
o HNO2 reageert met A&C ➔ foute baseparen maken ➔ transitie mutatie
• Oxidative damage
o Oxidatie van de basen, desoxyribose suikers, verwijderen van basen,
strand breaks
o Veroorzaakt kanker
• Damage by alkylation
o Alkylgroep op bases/ruggengraad zetten = alkylering
o Geen effect tot het helemaal verhinderen van basepairing
o Carcinogenen ➔ veroorzaakt kanker (vb benzo(a)pyrene in
cigaretten)
DNA repairmechanismen
Mismatch repair (MMR)
• Alleen de nucleotide bases in de nieuwe streng worden vervangen
o Net na het passeren van de replicatievork is er een stukje van de nieuwe streng een korte
periode ongemethyleerd (bacteriën)
• Herkent korte lussen (<4 bp) door template slippage ➔ deletie/insertie
,Direct repair
Beschadigde nucleotiden:
• Cross-links
o Photolyase gebruikt lichtenergie om de UV damage te herstellen en dus ook de cross links
• Alkylatie & oxidatie
Base excision repair (BER)
• 1 beschadigde base
• Verschil tussen bacteriën en eukaryoten ➔
• UDG (=uracil DNA glycosylase):
o Scant de helix ➔ damaged base recognition
door het DNA te breken en in de actieve site
van het enzym te zetten
Nucleotide excision repair (NER)
• Grotere stukken
• NER & BER = enkelstrengige breuken
,Recombination repair
• Dubbelstrengige breuken
• Homologe recombinatie (adhv zusterchromatide)
• Non-homologe recombinatie (adhv deleties/inserties ➔ !!meer mutaties!!) (NHEJ)
Translesion synthesis repair
• Als er een fout zit bij de replicatievork
• TLS = translesion synthesis
o Heeft geen proofreading 3’ -> 5’ exonuclease
en kan de fout in het DNA negeren (vaak is het
niet coderende regio ➔ geen E verspillen aan
nutteloze dingen)
Proces Voorbeeld Belangrijke enzymen
MMR Mismatched bp opgenomen door polymerase MutS/L
BER Oxidatieve schade/gealkyleerde basen DNA glycosylases (UDG)
Photoreactivation Pyrimidine dimeren afkomstig van UV licht DNA photolyase
NER Grotere gealkyleerde basen; pyrimidine dimeren Exinuclease
Recombinatie repair DNA double-strand breaks RecA recombinase
Translesion synthesis Abasic sites; gealkyleerde basen; pyrimidine TLS Pol
dimeren
, HC2 Recombinatie als herstelproces (H13)
Recombinatie als DNA repair proces
• Recombinatie = uitwisselen van genetisch materiaal tijdens
replicatie tussen 2 chromosomen (zelfde/ander allel/gen)
• Breuk in 1 streng = veel minder erg dan breuk in beide strengen
o 1 streng breuk ➔ gerepareerd adhv sequentie van
andere streng (complementair)
o 2 streng breuk = moeilijker ➔ kijken naar homologe
chromosomen of stukje eruit laten
• Proces: Overhangs maken ➔ strand invasions vormen holiday
junctions ➔ strand extension ➔ SDSA/DSBR
o SDSA (= synthesis-dependent strand annealing)
▪ We laten los, iedereen gaat terug naar zen plaats en je hebt terug de originele streng
➔ wisseling van genetische informatie is mogelijk
o DSBR (= double-strand break repair)
▪ Niet gewoon loslaten en ligeren, maar ook doorknippen (x-/y-richting)
o Branch migration ➔ holiday junctions schuiven over chromosoom
▪ Fork regression ➔ andere nieuwe streng gebruiken als template
o Gap repair ➔ hele streng gebruiken voor herstel
