Moleculaire Biologie Onderzoeken
Plan van Aanpak
Naam: Isabel de Vette
Studentnummer: 1141845
Klas: BM2O
Vak: MBO (Moleculaire Biologie Onderzoeken)
Docent: Boet van Riel
Sequenties: plasmide 1 + sequentie O
1
,Inhoudsopgave
1. Voorbereiding.....................................................................................................................................3
1.1 Identificatie juiste mRNA/eiwit vanuit gegeven RNA-sequentie...................................................3
2. Kloneringsstrategie 2.1 CDS, uitgagspunt primerontwerp..................................................................4
2.2 Onderdelen van de gegeven plasmide..........................................................................................4
2.3 Primers deel I: CDS-specifieke primers.........................................................................................5
2.4 Primers deel II: restrictiesites aan de primers...............................................................................7
2.5 Aanpassing voor in frame kloneren..............................................................................................8
2.6 Vectorkaartje (plasmide+insert) en gehele sequentie................................................................10
3. Uitvoering.........................................................................................................................................11
3.1 PCR programma..........................................................................................................................11
3.2 Herkomst PCR template..............................................................................................................12
4. Validatie............................................................................................................................................13
4.1 Voorstel voor plasmide controle op DNA-niveau........................................................................13
4.1.1 Contole met behulp van primers.........................................................................................13
4.1.2 Controle met behulp van restricite-enzymen......................................................................14
4.3 Suggestie voor methode om fusie-eiwit op te zuiveren.............................................................17
Bijlage 1: mRNA/cDNA sequentie van Cyclin A2...................................................................................18
Bijlage 2: volledige sequentie van plasmide met insert........................................................................20
Referentielijst.......................................................................................................................................23
2
, 1. Voorbereiding
1.1 Identificatie juiste mRNA/eiwit vanuit gegeven RNA-sequentie
Gegeven sequentie:
CAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCACAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATG
GTGTTTCTCTCCTCAACCCACCAGAGA
Aan de hand van de gegeven sequentie kan worden bepaald om welk gen van interesse het gaat. Dit
gen van interesse gaan we later in een plasmide zetten. In het programma BLAST kan de sequentie
worden ingevoerd, deze geeft verschillende eiwitten als uitkomst. Om te filteren welke het meest
overeen komt met de gegeven sequentie wordt bij ‘Percent Identity’ 100 to 100 ingesteld. Ook kan
bij ‘Organism’ Homo Sapiens worden ingevoerd, zo worden de resultaten van eiwitten uit eventuele
andere organismen niet weergegeven. De resultaten van BLAST na de gekozen filters zijn in
Afbeelding 1 weergeven.1
Afbeelding 1: resultaten na zoekopdracht BLAST
Voor de identificatie van het juiste eiwit is er een NM-nummer nodig, deze geeft het meest
betrouwbare resultaat. Dit is te zien bij het eerste resultaat uit Afbeelding 1 onder ‘Accesion’. In dit
geval heeft er maar 1 eiwit een NM-nummer, hier wordt voor gekozen. Homo sapiens Cyclin A2 is dus
het juiste eiwit wat bij de gegeven sequentie hoort. Hierbij hoort NM-nummer NM_001237 en het
gaat hier om gen CCNA2, dit is dus het gen van interesse.
3
Plan van Aanpak
Naam: Isabel de Vette
Studentnummer: 1141845
Klas: BM2O
Vak: MBO (Moleculaire Biologie Onderzoeken)
Docent: Boet van Riel
Sequenties: plasmide 1 + sequentie O
1
,Inhoudsopgave
1. Voorbereiding.....................................................................................................................................3
1.1 Identificatie juiste mRNA/eiwit vanuit gegeven RNA-sequentie...................................................3
2. Kloneringsstrategie 2.1 CDS, uitgagspunt primerontwerp..................................................................4
2.2 Onderdelen van de gegeven plasmide..........................................................................................4
2.3 Primers deel I: CDS-specifieke primers.........................................................................................5
2.4 Primers deel II: restrictiesites aan de primers...............................................................................7
2.5 Aanpassing voor in frame kloneren..............................................................................................8
2.6 Vectorkaartje (plasmide+insert) en gehele sequentie................................................................10
3. Uitvoering.........................................................................................................................................11
3.1 PCR programma..........................................................................................................................11
3.2 Herkomst PCR template..............................................................................................................12
4. Validatie............................................................................................................................................13
4.1 Voorstel voor plasmide controle op DNA-niveau........................................................................13
4.1.1 Contole met behulp van primers.........................................................................................13
4.1.2 Controle met behulp van restricite-enzymen......................................................................14
4.3 Suggestie voor methode om fusie-eiwit op te zuiveren.............................................................17
Bijlage 1: mRNA/cDNA sequentie van Cyclin A2...................................................................................18
Bijlage 2: volledige sequentie van plasmide met insert........................................................................20
Referentielijst.......................................................................................................................................23
2
, 1. Voorbereiding
1.1 Identificatie juiste mRNA/eiwit vanuit gegeven RNA-sequentie
Gegeven sequentie:
CAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCACAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATG
GTGTTTCTCTCCTCAACCCACCAGAGA
Aan de hand van de gegeven sequentie kan worden bepaald om welk gen van interesse het gaat. Dit
gen van interesse gaan we later in een plasmide zetten. In het programma BLAST kan de sequentie
worden ingevoerd, deze geeft verschillende eiwitten als uitkomst. Om te filteren welke het meest
overeen komt met de gegeven sequentie wordt bij ‘Percent Identity’ 100 to 100 ingesteld. Ook kan
bij ‘Organism’ Homo Sapiens worden ingevoerd, zo worden de resultaten van eiwitten uit eventuele
andere organismen niet weergegeven. De resultaten van BLAST na de gekozen filters zijn in
Afbeelding 1 weergeven.1
Afbeelding 1: resultaten na zoekopdracht BLAST
Voor de identificatie van het juiste eiwit is er een NM-nummer nodig, deze geeft het meest
betrouwbare resultaat. Dit is te zien bij het eerste resultaat uit Afbeelding 1 onder ‘Accesion’. In dit
geval heeft er maar 1 eiwit een NM-nummer, hier wordt voor gekozen. Homo sapiens Cyclin A2 is dus
het juiste eiwit wat bij de gegeven sequentie hoort. Hierbij hoort NM-nummer NM_001237 en het
gaat hier om gen CCNA2, dit is dus het gen van interesse.
3
