Instrumentele analyse 2:
scheidingstechnieken
Examenvragen
• Polair – apolair
• Blokschema
• Range
Chromatografie: basisprincipe
Scheiding uitvoeren: mengsel van verschillende componenten scheiden.
Kolomchromatografie
Kolom = stationaire fase (packing)
Mobiele fase: vloeistof
Indeling chromatografische technieken
Volgens techniek
LC
DLC: dunne laag chromatografie (afstand tot
aan de basislijn)
Stationaire fase: DLCplaat (silicaplaat,
celluloseplaat)
Mobiele fase: vloeistof/ (organisch) solvent
LC: Kolomchromatografie
GasChromatografie
Volgens aard mobiele fase
Vloeistofchromatografie (LC): kolomchromatografie of dunnelaagchromatografie (DLC)
Gaschromatografie (GC)
1
,Gaschromatografie
Animatie ppt
Componenten verschillende snelheid in kolom
Detector: chromatogram
Blokschema GC-FID (ex)
GasChromatografie
FID: vlamionisatiedetector (detector zal altijd anders zijn)
GC-scheidingsprincipe
Scheiding gebaseerd op kookpunt (vluchtigheid) en polariteit van de componenten
Je gaat een vloeistof injecteren à moeten naar de gasfase om geanalyseerd te worden door
een GC à verschillende componenten hebben een verschillend kookpunt (scheiden)
Vb. mengsel van alkanen (apolair, koolwaterstoffen) à chromatogram van C8 (octaan tot
C22 à Hoe kleiner molecule, hoe lager kookpunt, hoe sneller uit de kolom
Polariteit: interactie tussen kolom en componenten belangrijk
à alkanen: apolair
à alcoholen: polair
2
,Mengsel van ketonen, alkanen en alcoholen à niet op basis van kookpunt (chromatogram
boiling point)
Polaire-apolaire kolom à 3,6 en 9 gaan laat in het tweede chromatogram tevoorschijn
komen. Polaire componenten gaan tegen gehouden worden door de polaire kolom
(alcoholen -OH) (grotere retentietijd)
Inlet – manueel/autsampler
Autosampler: automatisch stalen aanvullen
Handmatig: lucht – staal – lucht opzuigen
Injectievolume: 1-10 µL
Inlet-Split/splitless injector
2 microliter staal injecteren
Splitless: volledig op de kolom terechtkomen
Mogelijk probleem: geen ‘mooie’ pieken
Oplossing: split injecteren à niet alles gaat naar de kolom à maar een kleine fractie à om
een mooi schromatogram te bekomen.
Splitverhouding gekozen bv. 1:20 à 1 deel naar kolom. 20 delen naar waste.
3
,Mobiele fase: draaggas (N2)
Totale flow in injector
Bij splitless: totale flow = kolomflow + purge fliw
Plit: totale flow = kolomflow + purge flow + split flow (met waste à gas + staal)
Purge flow
Aflsuiten van omgeving.
Staal verwijderen, zuigt aan, verontreinigingen van het staal, resten die niet bij injectieplaats
moeten ophopen (geen contaminatie)
Capillaire kolom
Specificaties:
• Lengte (m)
• Interne diameter (mm)
• Filmdikte (µm) (dikte vd stationaire fase)
Samenstelling stationaire fase à polariteit.
Stationaire fase: vloeistof die aan de binnenkant van de kolom kleeft (film) à dikte van
groene rand
Kortere kolom = kortere retentietijd (snellere scheiding maar kan ook soms te kort zijn om
scheiding te zien
Zelfde mengsel op 2 verschillende kolommen
Retentietijd verschilt
Piek 7: 1) 1,7 min 2)1,9 min
Volgorde verschilt ook: 1) acetaldehyde eerst 2) methanol eerst
4
, Oven
Kolom hangt in oven
Temperatuur is belangrijk
Isotherm vs. gradiënt
Temp blijft hetzelfde /cst = isotherme analyse
Temp blijft niet hetzelfde/stijgt = gradiënt analyse
à beter gescheiden: oventemp speelt een rol bij
de snelheid van de scheiding
Hoe hoger de temp à hoe sneller de scheiding
De eerste componenten bewegen trager maar
scheiding is beter. De laatste componenten
bewegen sneller.
Draaggas
Mobiele fase: inert gas (bv. N2 of He). Gas zit in een gascilinder (veiligheidsvoorschriften)
Detectr – FID
Flame Ionisation Detector
Goude ring (= herkenning detectiezone)
Verbrandingsreactie O2 nodig (via luchtaanvoer) + H2 nodig
Omzetting van organische stoffen (wat we willen analyseren)
(alkanen, alcoholen, …) naar e- + ionen à elektriciteit
à detector gaat stroomsterkte meten (pA = pico Ampère)
à vertalen naar piekopp of piekhoogte
5
,Registratie detectorsignaal
= opname van het chromatogram
De FID detector registreert een verschil in stroomsterkte (pA) wanneer een component de
detector bereikt en daar verbrand wordt.
Chromatogram
RT of TR: Retentietijd
T0: dodetijd
à tijd dat component nodig heeft als die niet w tegengehouden, om kolom af te leggen. Tijd
die mobiele fase nodig heeft om kolom af te leggen.
TR’ = TR – T0: verbeterde retentietijd
Wb: piekbreedte aan basis à afgemeten door raaklijnen te tekenen aan Gausscurve
W0,5 = W1/2: piekbreedte op halve hoogte.
6
,Registratie met papierrecorder
Range is een instelling van een GC-instrument waarmee de piekhoogte van de pieken op het
paier van de recorder beïnvloed worden. De range wordt aangeduid met 2X waarbij X
varieert van 1-13.
à hoe groter de range, hoe kleiner de piek
Als je van 3 à 5 gaat à piek zal 4x kleiner worden
23 25 à factor 22 à = 4x kleiner
GC-instrumenten met digitale registratie van gromatogrammen maken geen gebruik van de
instelling range.
Identificatie en kwantificatie van componenten
Identificatie (wat) via retentietijd
Kwantificatie (hoeveel, c, ..) via piekhoogte of piekopp
Kwantificatie van componenten
Een-punts-kalibratie
Ci = fi x hi
Ci = fi x Oppi
Bekende oplossing (standaard) nodig waarmee je de ijkfactor
kan mee berekenen
Ijklijnmethode
7
,Vloeistofchromatografie LC
Werkdomein:
Lc kan in vergelijking met GC op een breder terrein w toegepast.
Analysemethode w niet beperkt door vluchtigheid of thermische stabiliteit van de te
analyseren componenten.
Voorwaarde: de te analyseren componenten zijn oplosbaar of mengbaar met de vloeibare
mobiele fase
GC: vluchtige stoffen, uit elkaar vallen bij hoge temperaturen
Kolomchromatografie: het begin van LC (=Liquid Chromatography)
Kolom w gevild met stationaire fase (phase)
En mobiele fase
Opgevangen
Detecteren
Van kolomchromatografie naar HPLC = High Performance Liquid Chromatography
Manueel à instrumenteel
Hoge performatie: hoog kwalitatieve scheidingen (efficient, snel, …)
8
, Schema HPLC-instrument
sp
mp
Scheidingsprincipe
Componenten in een mengsel worden gescheiden op basis van hun verschil in affiniteit voor
de stationaire en mobiele fase
A,B,C
A B C
A B C
C minst lang onderweg, kleinste retentietijd Rt, grootste affiniteit mobiele fase
A gaat als laatste detector bereiken, grootste Rt, kleinste affiniteit mp, grootste affiniteit sp
(kolom)
Verdelingschromatografie
Moleculen lossen op in stationaire fase. Er stelt een evenwicht tss c moleculen in stationaire
en die in mobiele fase.
Scheiding van componenten is het gevolg van verschil in polariteit. (polariteit mobiele en
stationaire speelt rol).
Polariteit component rol SF & MF
(geen invloed van kookpunt zoals bij GC)
K = CS/Cm
Cs: c component stationaire fase
K: verhouding tussen aandeel in MF en SF aanduiden met evenwichtscste K
Grootste k waarde: component 3 à affiniteit SF à grote teller, kleine noemer
Kleinste k waarde: component 1 à affiniteit MF à grote noemer, kleine k (kleinste Rt)
Component
Mobiele fase
9
Stationaire fase
, Mobiele fase
Samenstelling mobiele fase (=eluens) à zo kiezen dat retentie van de te scheiden
componenten leidt tot chromatogram met voldoende resolutie. Polariteit eluens grote
invloed op scheiding.
Minst polair = meest apolair
Meest polair
Samenstelling: mobiele fase kan bestaan uit een mengsel van # solventen
Let op de mengbaarheid van de solventen die je wilt gebruiken
Isocratische elutie = constante elutiesterkte. Eluens is constant à lang experiment
Bv/ 80/20 MeOH/H2O
Gradiënt elutie: bv. van polair naar minder polaire oplossing (polariteit daalt) à laat
eluerende componenten gaan sneller elueren en Rt schuiven op (gaat niet met elke HPLC:
heeft ander pomp systeem nodig)
(GC: temperatuur veranderen van kolom in oven)
Kwaliteit van de solventen
- Ultrapuur water (Type I): zo weinig mogelijk contaminatie
- HPLC grade solventen: organische oplosmiddelen extra puur, veel zuivering, duur
Waarom zo zuiver materiaal: het toestel kan kapot gaan
(vuil ophopen in leidingen), je wilt niet dat er vanuit omgeving
componenten in zitten die je niet wil meten
(=contaminatie vermijden)
10
scheidingstechnieken
Examenvragen
• Polair – apolair
• Blokschema
• Range
Chromatografie: basisprincipe
Scheiding uitvoeren: mengsel van verschillende componenten scheiden.
Kolomchromatografie
Kolom = stationaire fase (packing)
Mobiele fase: vloeistof
Indeling chromatografische technieken
Volgens techniek
LC
DLC: dunne laag chromatografie (afstand tot
aan de basislijn)
Stationaire fase: DLCplaat (silicaplaat,
celluloseplaat)
Mobiele fase: vloeistof/ (organisch) solvent
LC: Kolomchromatografie
GasChromatografie
Volgens aard mobiele fase
Vloeistofchromatografie (LC): kolomchromatografie of dunnelaagchromatografie (DLC)
Gaschromatografie (GC)
1
,Gaschromatografie
Animatie ppt
Componenten verschillende snelheid in kolom
Detector: chromatogram
Blokschema GC-FID (ex)
GasChromatografie
FID: vlamionisatiedetector (detector zal altijd anders zijn)
GC-scheidingsprincipe
Scheiding gebaseerd op kookpunt (vluchtigheid) en polariteit van de componenten
Je gaat een vloeistof injecteren à moeten naar de gasfase om geanalyseerd te worden door
een GC à verschillende componenten hebben een verschillend kookpunt (scheiden)
Vb. mengsel van alkanen (apolair, koolwaterstoffen) à chromatogram van C8 (octaan tot
C22 à Hoe kleiner molecule, hoe lager kookpunt, hoe sneller uit de kolom
Polariteit: interactie tussen kolom en componenten belangrijk
à alkanen: apolair
à alcoholen: polair
2
,Mengsel van ketonen, alkanen en alcoholen à niet op basis van kookpunt (chromatogram
boiling point)
Polaire-apolaire kolom à 3,6 en 9 gaan laat in het tweede chromatogram tevoorschijn
komen. Polaire componenten gaan tegen gehouden worden door de polaire kolom
(alcoholen -OH) (grotere retentietijd)
Inlet – manueel/autsampler
Autosampler: automatisch stalen aanvullen
Handmatig: lucht – staal – lucht opzuigen
Injectievolume: 1-10 µL
Inlet-Split/splitless injector
2 microliter staal injecteren
Splitless: volledig op de kolom terechtkomen
Mogelijk probleem: geen ‘mooie’ pieken
Oplossing: split injecteren à niet alles gaat naar de kolom à maar een kleine fractie à om
een mooi schromatogram te bekomen.
Splitverhouding gekozen bv. 1:20 à 1 deel naar kolom. 20 delen naar waste.
3
,Mobiele fase: draaggas (N2)
Totale flow in injector
Bij splitless: totale flow = kolomflow + purge fliw
Plit: totale flow = kolomflow + purge flow + split flow (met waste à gas + staal)
Purge flow
Aflsuiten van omgeving.
Staal verwijderen, zuigt aan, verontreinigingen van het staal, resten die niet bij injectieplaats
moeten ophopen (geen contaminatie)
Capillaire kolom
Specificaties:
• Lengte (m)
• Interne diameter (mm)
• Filmdikte (µm) (dikte vd stationaire fase)
Samenstelling stationaire fase à polariteit.
Stationaire fase: vloeistof die aan de binnenkant van de kolom kleeft (film) à dikte van
groene rand
Kortere kolom = kortere retentietijd (snellere scheiding maar kan ook soms te kort zijn om
scheiding te zien
Zelfde mengsel op 2 verschillende kolommen
Retentietijd verschilt
Piek 7: 1) 1,7 min 2)1,9 min
Volgorde verschilt ook: 1) acetaldehyde eerst 2) methanol eerst
4
, Oven
Kolom hangt in oven
Temperatuur is belangrijk
Isotherm vs. gradiënt
Temp blijft hetzelfde /cst = isotherme analyse
Temp blijft niet hetzelfde/stijgt = gradiënt analyse
à beter gescheiden: oventemp speelt een rol bij
de snelheid van de scheiding
Hoe hoger de temp à hoe sneller de scheiding
De eerste componenten bewegen trager maar
scheiding is beter. De laatste componenten
bewegen sneller.
Draaggas
Mobiele fase: inert gas (bv. N2 of He). Gas zit in een gascilinder (veiligheidsvoorschriften)
Detectr – FID
Flame Ionisation Detector
Goude ring (= herkenning detectiezone)
Verbrandingsreactie O2 nodig (via luchtaanvoer) + H2 nodig
Omzetting van organische stoffen (wat we willen analyseren)
(alkanen, alcoholen, …) naar e- + ionen à elektriciteit
à detector gaat stroomsterkte meten (pA = pico Ampère)
à vertalen naar piekopp of piekhoogte
5
,Registratie detectorsignaal
= opname van het chromatogram
De FID detector registreert een verschil in stroomsterkte (pA) wanneer een component de
detector bereikt en daar verbrand wordt.
Chromatogram
RT of TR: Retentietijd
T0: dodetijd
à tijd dat component nodig heeft als die niet w tegengehouden, om kolom af te leggen. Tijd
die mobiele fase nodig heeft om kolom af te leggen.
TR’ = TR – T0: verbeterde retentietijd
Wb: piekbreedte aan basis à afgemeten door raaklijnen te tekenen aan Gausscurve
W0,5 = W1/2: piekbreedte op halve hoogte.
6
,Registratie met papierrecorder
Range is een instelling van een GC-instrument waarmee de piekhoogte van de pieken op het
paier van de recorder beïnvloed worden. De range wordt aangeduid met 2X waarbij X
varieert van 1-13.
à hoe groter de range, hoe kleiner de piek
Als je van 3 à 5 gaat à piek zal 4x kleiner worden
23 25 à factor 22 à = 4x kleiner
GC-instrumenten met digitale registratie van gromatogrammen maken geen gebruik van de
instelling range.
Identificatie en kwantificatie van componenten
Identificatie (wat) via retentietijd
Kwantificatie (hoeveel, c, ..) via piekhoogte of piekopp
Kwantificatie van componenten
Een-punts-kalibratie
Ci = fi x hi
Ci = fi x Oppi
Bekende oplossing (standaard) nodig waarmee je de ijkfactor
kan mee berekenen
Ijklijnmethode
7
,Vloeistofchromatografie LC
Werkdomein:
Lc kan in vergelijking met GC op een breder terrein w toegepast.
Analysemethode w niet beperkt door vluchtigheid of thermische stabiliteit van de te
analyseren componenten.
Voorwaarde: de te analyseren componenten zijn oplosbaar of mengbaar met de vloeibare
mobiele fase
GC: vluchtige stoffen, uit elkaar vallen bij hoge temperaturen
Kolomchromatografie: het begin van LC (=Liquid Chromatography)
Kolom w gevild met stationaire fase (phase)
En mobiele fase
Opgevangen
Detecteren
Van kolomchromatografie naar HPLC = High Performance Liquid Chromatography
Manueel à instrumenteel
Hoge performatie: hoog kwalitatieve scheidingen (efficient, snel, …)
8
, Schema HPLC-instrument
sp
mp
Scheidingsprincipe
Componenten in een mengsel worden gescheiden op basis van hun verschil in affiniteit voor
de stationaire en mobiele fase
A,B,C
A B C
A B C
C minst lang onderweg, kleinste retentietijd Rt, grootste affiniteit mobiele fase
A gaat als laatste detector bereiken, grootste Rt, kleinste affiniteit mp, grootste affiniteit sp
(kolom)
Verdelingschromatografie
Moleculen lossen op in stationaire fase. Er stelt een evenwicht tss c moleculen in stationaire
en die in mobiele fase.
Scheiding van componenten is het gevolg van verschil in polariteit. (polariteit mobiele en
stationaire speelt rol).
Polariteit component rol SF & MF
(geen invloed van kookpunt zoals bij GC)
K = CS/Cm
Cs: c component stationaire fase
K: verhouding tussen aandeel in MF en SF aanduiden met evenwichtscste K
Grootste k waarde: component 3 à affiniteit SF à grote teller, kleine noemer
Kleinste k waarde: component 1 à affiniteit MF à grote noemer, kleine k (kleinste Rt)
Component
Mobiele fase
9
Stationaire fase
, Mobiele fase
Samenstelling mobiele fase (=eluens) à zo kiezen dat retentie van de te scheiden
componenten leidt tot chromatogram met voldoende resolutie. Polariteit eluens grote
invloed op scheiding.
Minst polair = meest apolair
Meest polair
Samenstelling: mobiele fase kan bestaan uit een mengsel van # solventen
Let op de mengbaarheid van de solventen die je wilt gebruiken
Isocratische elutie = constante elutiesterkte. Eluens is constant à lang experiment
Bv/ 80/20 MeOH/H2O
Gradiënt elutie: bv. van polair naar minder polaire oplossing (polariteit daalt) à laat
eluerende componenten gaan sneller elueren en Rt schuiven op (gaat niet met elke HPLC:
heeft ander pomp systeem nodig)
(GC: temperatuur veranderen van kolom in oven)
Kwaliteit van de solventen
- Ultrapuur water (Type I): zo weinig mogelijk contaminatie
- HPLC grade solventen: organische oplosmiddelen extra puur, veel zuivering, duur
Waarom zo zuiver materiaal: het toestel kan kapot gaan
(vuil ophopen in leidingen), je wilt niet dat er vanuit omgeving
componenten in zitten die je niet wil meten
(=contaminatie vermijden)
10
