Samenvatting materials and methods to analyse your epigenome

Materials and methods to
analyze your epigenome
Histone modifications
Western blot/ELISA

 Antilichamen gemaakt specifiek tegen modificaties van histon aminozuren
o Slechts één modificatie tegelijk bestuderen mogelijk
→ verschillende patiëntenstalen of cellijnen onderzoeken met deze methode wordt
zeer duur, gezien één antilichaam snel €500 zou kosten
 Histonen isoleren en antilichamen met fluorescente tag toevoegen
o Met toenemende hoeveelheid van bepaalde modificatie fluorescentie meten
→ simpelste methode om te weten of histon gemodificeerd is
o Probleem: verschillende labo’s gebruiken verschillende commerciële bronnen van
antilichamen
 Bv: één commerciële bron van antilichamen herkende enkel fosforylatie van
S10 indien K9 tegelijk ook geacetyleerd was
 Soms kan fosfo-antilichaam niet herkent worden als er een
acetylgroep gebonden zijn op K9 = epitoop-occlusie
 K9 kan ook gemethyleerd worden naast acetylatie
→ tegenstrijdige resultaten kunnen verkregen worden
Proteomics

 Eiwit verknippen met protease en dan alle peptides scheiden op basis van verschil in massa
o Extractie van histonen bij een heel zure pH (HCl of H 2SO4)
→ enkel histonen gaan in oplossing, andere structuren gaan kapot
 Via proteases histonen verknippen in peptides
o Peptides kennen een massa, maar als er acetylgroep of methylgroep op zit zal er een
verschuiving in massa optreden
 Alle mogelijke combinaties per peptide geeft 64 mogelijke
massaverschuivingen voor een peptide met 3 lysines
 Een aantal combinaties geven dezelfde massaverschuivingen
→ Trainen van computers om deze verschuivingen te analyseren
 Patroon van peptide zal uiteindelijk wel verkregen worden, maar de
rekentijd om de modificaties te achterhalen wordt astronomisch
groot
 Staal van histonen in proteoommachine steken en zoeken naar clusters
o Massaverschuivingen zoeken en onderzoeken waar pieken zich bevinden
→ zoeken van patronen
 Patronen kunnen mogelijks wijzen op bepaalde zaken
 Gezien volledige dataset lange rekentijd zou innemen, wordt de dataset vereenvoudigd tot
50 meest voorkomende clusters → hierop meer gedetailleerde analyse uitvoeren




1

, Immunofluorescentie

 Onderzoeken of specifieke histonvarianten wel of niet aanwezig zijn
o Co-localisatie van bepaalde modificaties
 Antilichaam gebasseerde methode, dus altijd gevaar voor epitoop-occlusie
o Bias mogelijk door de te weinig specificiteit van de antilichamen voor modificaties
o Ook rekening houden met de emissiespectra van fluoroforen
 Spectra kunnen interfereren en extra bias geven
 Als pieken te dicht bij elkaar zitten, maakt dit dat signalen niet meer
correct kunnen geïdentificeerd worden

Mass spect cytometry

 In plaats van antilichamen te labelen met fluorescente kleurstoffen worden er metalen
gebonden met elk verschillende isotoopmassa
o Beads met unieke masse → niet langer kijken naar lichtsignaal, maar naar de
aan-/afwezigheid van bepaalde massas
 50 antilichamen allen tegen verschillende histonmodificaties met allen ander metaal label
→ signaal van bepaalde massa is aan of afwezig indien modificaties aan of afwezig is
o Op deze manier kunnen tot 135 verschillende antilichamen tegelijk kwantificeren,
wat onmogelijk was met immunofluorescentie of flowcytometrie

Chromatine immunoprecipitatie

 Cellen crosslinken aan DNA met formaldehyde → ChIP-base gevormd
o Base reageert met lysine en nadien met cytosine
→ lysine van histonen binden met cytosine van DNA
 Sonicatie (ultrasone trillingen of enzymatisch) zal lengte reduceren
→ fragmentjes van DNA gevormd met allen bepaalde modificaties
o Antilichamen toevoegen tegen specifieke modificaties
 Maar één per staal mogelijk
 Antilichaam bindt op nucleosoom met bepaalde modificatie
 Immunoprecipitatie: cefarose beads toevoegen aan mengsel met affiniteit voor antilichamen
→ beads kleven aan antilichamen → zware bead gevormd → chromatine DNA
geprecipiteerd
o Aan bodem epje zitten fragmenten gebonden aan beads
 Om te weten welk stukje DNA gebonden is hebben we reverse crosslinking
nodig → staal opwarmen maakt dat histonen loskomen van DNA
→ isoleren van DNA → PCR uitvoeren
 Enkele verschillen tegenover de proteoom analyse
o Bij proteoom: alle histonen uit de cel halen, zonder te weten aan welk DNA ze kleven
o Bij ChIP: door crosslinking geweten welke DNA fragmenten aanwezig zijn
 Met PCR nadien zien of DNA in bound of unbound fractie zat van de beads
 Ook mogelijk om in plaats van PCR of hybridisatie op het einde een next generation
sequencing uit te voeren op alle geprecipiteerde fragmenten → ChIP-QPCR
o Pieken zijn fragmenten die geacetyleerde histonen dragen
 Van elke histonmodificatie geweten waar in het genoom deze aanwezig is
→ map maken van histonnmodificaties waarvan antilichamen gekend zijn
 Probleem: heel veel cellen nodig voor chromatine precipitatie
→ botsen zo op limieten van sensitiviteit

2