MIC
Chapitre 2 : Structure et ultrastructure des bactéries.
I. Techniques d’études
1. Le microscope
Elles sont microscopiques, donc utilisation du microscope.
Le microscope photonique à une résolution faible de 0,2 micromètres, de photons, donc de
lumière blanche. Les photons passeront à travers des lentilles de verres. L’illumination de
l’échantillon se fait par transmission de la lumière blanche, donc des rayons lumineux qui
limitent le pouvoir de séparation, d’où la résolution faible.
Elle conduit également à un faible contraste.
On a 2 types de microscopes photoniques :
A fond clair : le spécimen est éclairé par-dessous et observé par-dessus.
Les cellules apparaissent plus ou moins foncé sur un fond clair. Et ceci est le fait d’un
faible variation entre l’indice de réfraction entre l’air ou l’eau et la cellule.
Si le microscope est éclairé par-dessus, on a un microscope inversé. Donc l’objectif
est situé en dessous de la préparation. Le microscope va permettre de déterminer la
morphologie de la bactérie (ou ce qu’on observe en général), si c’est un milieu
liquide, on peut observer la mobilité. Mais également de voir des colorations,
augmentant le contraste et donc de mieux visualiser.
A fond noir : On éclaire par les côtés, avec une lumière rasante, et on observe, on
collecte uniquement la lumière diffusée par le spécimen. Donc ces cellules vont
apparaître claires, sur un fond noir. Ce microscope va permettre d’augmenter le
contraste, mais ne changera rien à la résolution.
On a des microscopes à fluorescence (exciter les molécules fluorescentes pour pouvoir les
visualiser).
Certaines cellules ont une fluorescence naturelle. Après excitation, les composés
produits, vont émettre la lumière à une énergie plus basse que celle qu’on lui a
fourni. Donc un microscope à fluorescence est un microscope optique équipé d’un
laser. C’est le laser qui excite la cellule qui possède des caractères fluorescents,
appelé fluorochrome. Le fluorescence peut être naturelle, pour pseudomonas, on
retrouve la pyocyanine, et la pyoverdine.
On peut également marquer des structures à l’aide d’anticorps fluorescents (en
attachant un fluorochrome), permettant de visualiser une structure cellulaire
particulière (rhodamine, zodopsine, fluorescéine). Permet d’avoir une meilleure
résolution, et utilisable dans des techniques.
Ou encore traitement par des fluorochromes. Le DAPI va se fixer au niveau de l’ADN,
où il va venir se colorer en bleu. La molécule de DAPI pourra traverser la membrane
plasmique, permettant de voir l’ADN des bactéries vivantes et mortes.
Le SITOX est une molécule fluorescente également, qui peut être bleu ou rouge, qui
a pour particularité de pénétrer que dans des cellules mortes. Cette technique est
très utilisée en cytométrie en flux, pour compter des micro-organismes appartenant
à une niche écologique particulière.
, Ou en utilisant un colorant métabolique comme le CTC (cyano ditolyl tétrazolium
chloride). Elle sera fluorescente uniquement si elle est réduite. Et la réduction de
cette molécule se fait par une enzyme de la respiration.
Par fusion d’un gène d’une protéine fluorescente avec un gène de la protéine qu’on
veut suivre (GFP).
2. Le microscope électronique
La résolution est bien plus importante, soit une résolution de 0,2 à 100 nm, permettant de
visualiser les ultrastructures.
On a des microscope électronique à transmission, où on a remplacé les lentilles de
verres, par une source d’électrons, avec une dispositif électromagnétique, et sous
vide. On a donc un flux d’électrons qui traverse la préparation.
La préparation est une coupe ultra fine des cellules de quelques 10e de nm
d’épaisseur, grâce au cryodécapage. Qu’on place ensuite sous vide pour faire des
observations, qui se fait en fonction de la densité, permettant d’atteindre la
structure interne de la cellule.
Ou encore des microscopes à balayage, où on a encore une meilleure résolution.
L’échantillon sera recouvert d’une fine couche d’un métal lourd comme l’or. On a un
faisceau d’électron qui balayent la surface de l’échantillon, arrivant sur les métaux
lourds, et seront ensuite dispersé par le métal et collecté sur un écran d’ordinateur
qui reproduit l’image.
On peut faire des coupes mais on peut également avoir la cellule entière.
3. Cytosolique
-Etat frais : observé sa morphologie, sa mobilité (elles ne sont pas toutes mobiles).
En mobilité on peut décrire son déplacement ( linéaire, tourbillon) on peut envisager le
mode de ciliature selon le déplacement. On peut en déterminer la taille.
Selon l’endroit de récupération on peut avoir des modes de groupement qui peuvent varier
selon l’endroit, le mode de déplacement peut aussi varier selon l’endroit exemple les
microorganismes issus d’un biofilms ( matrice) les bactéries perdent leurs flagelles donc ne
se déplacent pas alors que seul elles peuvent se déplacer.
On peut avoir une estimation de la densité bactérienne si on a un polymicrobien que l’on
peut distinguer on peut avoir une proportion de l’un par rapport à l’autre.
Les observations peuvent aborder le diagnostique de l’identification bactérienne.
-colorations : frottis+ fixations des cellules donc les cellules ne bougent plus, les
bactéries sont mortes. Le colorant est rincé pour visualiser le colorant introduit dans la
cellule ou fixer de façon spécifique sur certaines structures de la bactérie. On peut observer
la morphologie, le mode de groupement possible seulement si le frottis est fait étaler, si
mobile=isolés. On peut dire si c’est coloré ou non=gram.
On peut avoir des colorations simples comme le vert de malachite qui colore les spores,
également la capsule qui se trouvent au-dessus de la paroi, mettre en évidence les flagelles.
On peut avoir des colorations différentielles comme la coloration de Gram.
On peut déterminer la taille de la bactérie.
L’ordre de grandeur des bactéries est de l’ordre du micromètre, les plus petites sont les
chlamydias qui font 2 micromètres, les plus longues sont les spirochètes qui font 250
Chapitre 2 : Structure et ultrastructure des bactéries.
I. Techniques d’études
1. Le microscope
Elles sont microscopiques, donc utilisation du microscope.
Le microscope photonique à une résolution faible de 0,2 micromètres, de photons, donc de
lumière blanche. Les photons passeront à travers des lentilles de verres. L’illumination de
l’échantillon se fait par transmission de la lumière blanche, donc des rayons lumineux qui
limitent le pouvoir de séparation, d’où la résolution faible.
Elle conduit également à un faible contraste.
On a 2 types de microscopes photoniques :
A fond clair : le spécimen est éclairé par-dessous et observé par-dessus.
Les cellules apparaissent plus ou moins foncé sur un fond clair. Et ceci est le fait d’un
faible variation entre l’indice de réfraction entre l’air ou l’eau et la cellule.
Si le microscope est éclairé par-dessus, on a un microscope inversé. Donc l’objectif
est situé en dessous de la préparation. Le microscope va permettre de déterminer la
morphologie de la bactérie (ou ce qu’on observe en général), si c’est un milieu
liquide, on peut observer la mobilité. Mais également de voir des colorations,
augmentant le contraste et donc de mieux visualiser.
A fond noir : On éclaire par les côtés, avec une lumière rasante, et on observe, on
collecte uniquement la lumière diffusée par le spécimen. Donc ces cellules vont
apparaître claires, sur un fond noir. Ce microscope va permettre d’augmenter le
contraste, mais ne changera rien à la résolution.
On a des microscopes à fluorescence (exciter les molécules fluorescentes pour pouvoir les
visualiser).
Certaines cellules ont une fluorescence naturelle. Après excitation, les composés
produits, vont émettre la lumière à une énergie plus basse que celle qu’on lui a
fourni. Donc un microscope à fluorescence est un microscope optique équipé d’un
laser. C’est le laser qui excite la cellule qui possède des caractères fluorescents,
appelé fluorochrome. Le fluorescence peut être naturelle, pour pseudomonas, on
retrouve la pyocyanine, et la pyoverdine.
On peut également marquer des structures à l’aide d’anticorps fluorescents (en
attachant un fluorochrome), permettant de visualiser une structure cellulaire
particulière (rhodamine, zodopsine, fluorescéine). Permet d’avoir une meilleure
résolution, et utilisable dans des techniques.
Ou encore traitement par des fluorochromes. Le DAPI va se fixer au niveau de l’ADN,
où il va venir se colorer en bleu. La molécule de DAPI pourra traverser la membrane
plasmique, permettant de voir l’ADN des bactéries vivantes et mortes.
Le SITOX est une molécule fluorescente également, qui peut être bleu ou rouge, qui
a pour particularité de pénétrer que dans des cellules mortes. Cette technique est
très utilisée en cytométrie en flux, pour compter des micro-organismes appartenant
à une niche écologique particulière.
, Ou en utilisant un colorant métabolique comme le CTC (cyano ditolyl tétrazolium
chloride). Elle sera fluorescente uniquement si elle est réduite. Et la réduction de
cette molécule se fait par une enzyme de la respiration.
Par fusion d’un gène d’une protéine fluorescente avec un gène de la protéine qu’on
veut suivre (GFP).
2. Le microscope électronique
La résolution est bien plus importante, soit une résolution de 0,2 à 100 nm, permettant de
visualiser les ultrastructures.
On a des microscope électronique à transmission, où on a remplacé les lentilles de
verres, par une source d’électrons, avec une dispositif électromagnétique, et sous
vide. On a donc un flux d’électrons qui traverse la préparation.
La préparation est une coupe ultra fine des cellules de quelques 10e de nm
d’épaisseur, grâce au cryodécapage. Qu’on place ensuite sous vide pour faire des
observations, qui se fait en fonction de la densité, permettant d’atteindre la
structure interne de la cellule.
Ou encore des microscopes à balayage, où on a encore une meilleure résolution.
L’échantillon sera recouvert d’une fine couche d’un métal lourd comme l’or. On a un
faisceau d’électron qui balayent la surface de l’échantillon, arrivant sur les métaux
lourds, et seront ensuite dispersé par le métal et collecté sur un écran d’ordinateur
qui reproduit l’image.
On peut faire des coupes mais on peut également avoir la cellule entière.
3. Cytosolique
-Etat frais : observé sa morphologie, sa mobilité (elles ne sont pas toutes mobiles).
En mobilité on peut décrire son déplacement ( linéaire, tourbillon) on peut envisager le
mode de ciliature selon le déplacement. On peut en déterminer la taille.
Selon l’endroit de récupération on peut avoir des modes de groupement qui peuvent varier
selon l’endroit, le mode de déplacement peut aussi varier selon l’endroit exemple les
microorganismes issus d’un biofilms ( matrice) les bactéries perdent leurs flagelles donc ne
se déplacent pas alors que seul elles peuvent se déplacer.
On peut avoir une estimation de la densité bactérienne si on a un polymicrobien que l’on
peut distinguer on peut avoir une proportion de l’un par rapport à l’autre.
Les observations peuvent aborder le diagnostique de l’identification bactérienne.
-colorations : frottis+ fixations des cellules donc les cellules ne bougent plus, les
bactéries sont mortes. Le colorant est rincé pour visualiser le colorant introduit dans la
cellule ou fixer de façon spécifique sur certaines structures de la bactérie. On peut observer
la morphologie, le mode de groupement possible seulement si le frottis est fait étaler, si
mobile=isolés. On peut dire si c’est coloré ou non=gram.
On peut avoir des colorations simples comme le vert de malachite qui colore les spores,
également la capsule qui se trouvent au-dessus de la paroi, mettre en évidence les flagelles.
On peut avoir des colorations différentielles comme la coloration de Gram.
On peut déterminer la taille de la bactérie.
L’ordre de grandeur des bactéries est de l’ordre du micromètre, les plus petites sont les
chlamydias qui font 2 micromètres, les plus longues sont les spirochètes qui font 250
