Samenvatting les 4/6 van Biotechnologie

Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies


Recap: van DNA naar construct

,Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies


- Kennis van de finale applicatie leidt de tussenliggende stappen
- Meerder manieren om EW te klonen, subklonen, tot expressie brengen en zuiveren
o Zijn allemaal correct maar sommigen meer kans om te werken of zijn sneller.
- Kloneringskuzes
o Bron van DNA
o Verschillende methodologieën voor DNA-assemblage
- Expressiekeuzes
o Keuze van expressiesysteem (en subkloneringsstrategie)
o Keuze van zuiveringstags (purification tags)
o Keuze van linkers


scFV (IgG)
= single chain variable fragment
- Fv: 3 CDR-lussen waar Ab bindingspotentieel heeft, specifiek voor een bepaald doelwit.
- Voor toepassing: maak scAb MAAR begin met DNA = ½ van Fv gecodeerd in ene gen en
andere ½ gecodeerd in ander gen DUS assembleer 2 genen.
o Samen = klein eiwit: lage glycosylering + niet giftig.
 Gastheer kan E. Coli zijn
 Expressie kan IPTG systeem zijn
- Hoge zuiverheid nodig

Linkers en tags
- Variëren van een paar AZ tot hele fusiedomeinen
- Tags invloed op: zuivering, lokalisatie, labeling en vouwen.
o Intein tag = sequenties die zichzelf uit een EW kunnen splitsen.
o Impact tag een gemanipuleerd inteïne, gefuseerd met CBD = chitine-binden domein.
 CBD zorgt dat getagde EW efficiënt in kolom vastligt + inteïne actief 
selectieve elutie van sterk gezuiverd tot expressie gebracht EW.
- Linker = elke EW-sequentie die 2 PoI’s koppelt, die samen TxL ondergaan.


Typische planning
- Plasmide bevat al regulatie van TxN.
- pET met His-tag: snelle zuivering maar niet selectief
o Alternatieve zuiveringsstrategie nodig
- EW-linkers: scheiden individuele componenten van PoI en tussen PoI en zuiveringstag.
- Nu componenten zijn bepaald, kan montage gepland worden, incl. reviseren componenten.

VH = variable heavy VL = variable light: top van IgG, samen vormen ze IgG-bindingsplaats, afkomstig
van een single Ab.

Gebruik intein purificatie tag want we willen hoge zuiverheid, beter dan His-tag.
Je weet hoe je je PoI wil hebben: je kan ook enkele componenten herzien, hier is hoeveelheid
engineering die ik in pET28 moet doen, om alle deze van constructie op te nemen, aanzienlijk  kies
om met andere vector te werken (construct in 1w): reduceert probleem = 3 fragmenten ipv 5.

Captaliseer SapI-fragment of SapI endonuclease plaats voor klonering.

, Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies


Kloon de laatste overhang, vanwege flexibiliteit bij samenstellen van fragment, kies ik ook type IIS.
Voorkant kies ik voor een stom uiteinde.
Codeer de linker als primeroverhang: assembleer niet meerdere fragmenten MAAR 2x PCR om
fragment te amplificeren en type IIS samen samen met blunt end kan ik klonen.




GSSGS-EW toevoegen tussen PoI en TEV-tag
- Glycine en Serine = kleine sterke polaire AZ  flexibele tag genereren 
kans dat TEV-tag beschikbaar is voor proteasen stijgt.

Overhang kiezen voor type IIS-klonen om niets over te laten tussen VL en
purificatie tag.
- SapI plaats in pTX1 plasmide strategisch geplaatst:
o Overhang = sequentie die codeert voor Cysteïne dat later door Inteïn geplitst wordt.
- Als je die overhangende sequentie gebruikt  tot expressie gebrachte EW bij Cysteïne
afgesplitst  geen enkel toegevoegd AZ blijft achter (IIS = zonder scar).

Linker tussen VL en purificatie tag om purificatie tag te verwijderen
- PT = intein-CBD: activatie inteïne  splitsing en afgifte van EW = geen linker nodig.
- PT = His-tag
o Vaak zonder linker
o Indien wel linker: varieert van 1 AZ tot meer gevestigde linker en variaties daarvan.
 G4S (variatie = GSSGS)
Biotherapeutische engineering
Reikwijdte
- Punt mutaties, inserties en deleties
- Chemische aanhechting van aanvullende chemische functionaliteit
- Onnatuurlijke AZ
- Tags (zuivering)
- Domein wisselingen (chimere Ab)