ALGEMENE ACHTERGROND
- Zie theorie verdunningsoefeningen (enkelvoudige, seriële, KOVA-telkamer
- Zie verbeterde oefeningen op Blackboard
EXPERIMENT 1: IMMUNOCHEMIE
DOEL: concentratie van 2 onbekende stalen (A en B) bepalen dmv van Enzym Immuno Assay (EIA)
EIA: competitief direct heterogeen systeem
- Competitief: eiwit (Ag) gaat in competitie met ander eiwit voor binding op Ab (kunnen beide binden)
- Direct: visualisatie van het eiwit gebeurt met 1 antilichaam
- Heterogeen: onbekende stalen bevatten versch. types eiwitten (Ag) waarvan 1 te onderscheiden is
ALGEMEEN: VISUALISATIE VAN HET GEBONDEN ANITGEN (EIWIT)
- Biotine-label toevoegen
- Complexvorming van het Ag met biotine: nog steeds niet waarneembaar
- Toevoegen van avidine biotine complex: ABC-complex bindt aan biotine
o Horse radish peroxidase (HRP = enzym dan aan ABC-complex is gebonden)
- Visualisatie gebeurt pas door toevoegen substraat: kleurt bauw (dankzij enzym op ABC-complex)
- De blauwe kleur is onstabiel, daarom toevoegen stop oplossing: blauw (instabiel) à geel (stabiel)
= DIRECT SYSTEEM
STAP 1: SPECIFIEK ANTILICHAAM BINDEN AAN DE PLAAT
- Onbekende A en B bevatten meerdere typen van eiwitten (heterogeen)
- Specifieke Ab gebruiken, waardoor slechts 1 type (gewenste antigen) eiwit hieraan zal binden
- Het Ag (eiwit) is gebonden aan het Ab, maar dit is nog niet waarneembaar
1
, STAP 2: ANTIGEN BIOTINYLEREN + ANTIGEN OPZUIVEREN (+ KALIBRATIE)
- Overmaat aan biotine toegevoegd aan Ag: zeker dat elk Ag een biotinelabel verkrijgt
- Overschot biotine kan interfereren met resultaten want kan nog steeds binden aan ABC-complex enz.
- Overmaat niet-gebonden biotine wordt weggehaald dmv gelfiltratie
Gelfiltratie: ontzoutingskolom gevuld met Sephadex korrels = scheiding o.b.v. grootte en moleculaire massa
- Grote gelabeld Ag dringt niet in de poreuze gel: kortere elutietijd, gaan als eerst uit de kolom
- Kleine ongebonden biotine dringen in de poreuze gel: langere elutietijd, komen trager uit kolom
Kalibratie van de kolom met BD-2000 (Blue Dextran)
- Biotine (gelabeld of ongelabeld) is kleurloos, daarom niet zichtbaar als het uit kolom loopt
- Blue Dextran heeft dezelfde moleculaire massa (grootte) als het biotine gelabeld Ag
- Doen er dus even lang over om door de kolom te lopen en komen in zelfde fractie terecht
Laat eerst het BD-2000 door de kolom laat lopen en vang deze fracties op. Zo weet je dat in de (meest) blauwe
fracties het BD-2000 zich bevindt. Wanneer je nu de antigen-biotine mengsel elueert, weet je in welke fracties
het gelabeld biotine terecht is gekomen (zelfde fracties als BD, want zelfde moleculaire massa)
STAP 3: CONCENTRATIE BEPALING VAN HET GEZUIVERD Ag-B
- Ijkcurve opstellen adhv verdunningen met BSA (bovine serum albumine, referentie-eiwit)
- Bradford reagens toegevoegd aan verdunningen: bindt aan eiwit (Ag) à blauwe kleur à OD bepaling
- Adhv ijkcurve kan concentratie Ag-B (conc. opgevangen fracties) bepaald worden (zie verslag)
STAP 4: COMPETITIE SYSTEEM (ZIE IN BUNDEL: STANDAARDCURVE MAKEN)
Probleem: we beginnen met een heterogeen complex, dus het andere type eiwit krijgt ook biotine label, dit
willen we niet. Hierdoor gaan we gebruik moeten maken van een competitie systeem
- Eigen onbekenden: niet biotinyleren
- Aparte stock van hetzelfde antigen (gekende conc.): wel biotinyleren! = controlegroep
- Controlegroep in competitie laten treden (=competitiesysteem)
Verdunningsreeks van ongelabeld antigen maken
Overal dezelfde hoeveelheid biotine-gelabeld Ag toevoegen
- Daarnaast voeg je aan de 2 onbekende stalen diezelfde hoeveelheid biotine-gelabeld Ag toe
- Voeg ABC-complex toe aan alle (gebruikte wells)
- Voeg vervolgens substraatoplossing toe: instabiele blauwe kleur à stop oplossing: stabiele gele kleur
Zie P15 bundel:
Gaat de eerste kolom donker of licht gekleurd zijn? Donker gekleurd (weinig licht doorgelaten, hoge OD) want
je hebt veel meer van uw ongelabeld Ag dan van uw gelabeld Ag. Het gelabelde Ag gaat bijna niet kunnen
binden aan het Ab. Hoe minder van het ongelabelde aanwezig (verdere kolommen (verdunningsreeks)), hoe
meer gelabeld Ag aanwezig gaat zijn, hoe lichter gekleurd het eruit zal zien (meer licht doorgelaten).
Het competitief systeem is dus een omgekeerd systeem. Hoe meer onbekende (ongelabeld) je hebt, hoe
minder licht omdat je eigenlijk de plaatsen inpikt van het antigen met label.
- Concentratiebepaling door opstellen standaardcurve met gekende concentratie aan hetzelfde Ag
2
- Zie theorie verdunningsoefeningen (enkelvoudige, seriële, KOVA-telkamer
- Zie verbeterde oefeningen op Blackboard
EXPERIMENT 1: IMMUNOCHEMIE
DOEL: concentratie van 2 onbekende stalen (A en B) bepalen dmv van Enzym Immuno Assay (EIA)
EIA: competitief direct heterogeen systeem
- Competitief: eiwit (Ag) gaat in competitie met ander eiwit voor binding op Ab (kunnen beide binden)
- Direct: visualisatie van het eiwit gebeurt met 1 antilichaam
- Heterogeen: onbekende stalen bevatten versch. types eiwitten (Ag) waarvan 1 te onderscheiden is
ALGEMEEN: VISUALISATIE VAN HET GEBONDEN ANITGEN (EIWIT)
- Biotine-label toevoegen
- Complexvorming van het Ag met biotine: nog steeds niet waarneembaar
- Toevoegen van avidine biotine complex: ABC-complex bindt aan biotine
o Horse radish peroxidase (HRP = enzym dan aan ABC-complex is gebonden)
- Visualisatie gebeurt pas door toevoegen substraat: kleurt bauw (dankzij enzym op ABC-complex)
- De blauwe kleur is onstabiel, daarom toevoegen stop oplossing: blauw (instabiel) à geel (stabiel)
= DIRECT SYSTEEM
STAP 1: SPECIFIEK ANTILICHAAM BINDEN AAN DE PLAAT
- Onbekende A en B bevatten meerdere typen van eiwitten (heterogeen)
- Specifieke Ab gebruiken, waardoor slechts 1 type (gewenste antigen) eiwit hieraan zal binden
- Het Ag (eiwit) is gebonden aan het Ab, maar dit is nog niet waarneembaar
1
, STAP 2: ANTIGEN BIOTINYLEREN + ANTIGEN OPZUIVEREN (+ KALIBRATIE)
- Overmaat aan biotine toegevoegd aan Ag: zeker dat elk Ag een biotinelabel verkrijgt
- Overschot biotine kan interfereren met resultaten want kan nog steeds binden aan ABC-complex enz.
- Overmaat niet-gebonden biotine wordt weggehaald dmv gelfiltratie
Gelfiltratie: ontzoutingskolom gevuld met Sephadex korrels = scheiding o.b.v. grootte en moleculaire massa
- Grote gelabeld Ag dringt niet in de poreuze gel: kortere elutietijd, gaan als eerst uit de kolom
- Kleine ongebonden biotine dringen in de poreuze gel: langere elutietijd, komen trager uit kolom
Kalibratie van de kolom met BD-2000 (Blue Dextran)
- Biotine (gelabeld of ongelabeld) is kleurloos, daarom niet zichtbaar als het uit kolom loopt
- Blue Dextran heeft dezelfde moleculaire massa (grootte) als het biotine gelabeld Ag
- Doen er dus even lang over om door de kolom te lopen en komen in zelfde fractie terecht
Laat eerst het BD-2000 door de kolom laat lopen en vang deze fracties op. Zo weet je dat in de (meest) blauwe
fracties het BD-2000 zich bevindt. Wanneer je nu de antigen-biotine mengsel elueert, weet je in welke fracties
het gelabeld biotine terecht is gekomen (zelfde fracties als BD, want zelfde moleculaire massa)
STAP 3: CONCENTRATIE BEPALING VAN HET GEZUIVERD Ag-B
- Ijkcurve opstellen adhv verdunningen met BSA (bovine serum albumine, referentie-eiwit)
- Bradford reagens toegevoegd aan verdunningen: bindt aan eiwit (Ag) à blauwe kleur à OD bepaling
- Adhv ijkcurve kan concentratie Ag-B (conc. opgevangen fracties) bepaald worden (zie verslag)
STAP 4: COMPETITIE SYSTEEM (ZIE IN BUNDEL: STANDAARDCURVE MAKEN)
Probleem: we beginnen met een heterogeen complex, dus het andere type eiwit krijgt ook biotine label, dit
willen we niet. Hierdoor gaan we gebruik moeten maken van een competitie systeem
- Eigen onbekenden: niet biotinyleren
- Aparte stock van hetzelfde antigen (gekende conc.): wel biotinyleren! = controlegroep
- Controlegroep in competitie laten treden (=competitiesysteem)
Verdunningsreeks van ongelabeld antigen maken
Overal dezelfde hoeveelheid biotine-gelabeld Ag toevoegen
- Daarnaast voeg je aan de 2 onbekende stalen diezelfde hoeveelheid biotine-gelabeld Ag toe
- Voeg ABC-complex toe aan alle (gebruikte wells)
- Voeg vervolgens substraatoplossing toe: instabiele blauwe kleur à stop oplossing: stabiele gele kleur
Zie P15 bundel:
Gaat de eerste kolom donker of licht gekleurd zijn? Donker gekleurd (weinig licht doorgelaten, hoge OD) want
je hebt veel meer van uw ongelabeld Ag dan van uw gelabeld Ag. Het gelabelde Ag gaat bijna niet kunnen
binden aan het Ab. Hoe minder van het ongelabelde aanwezig (verdere kolommen (verdunningsreeks)), hoe
meer gelabeld Ag aanwezig gaat zijn, hoe lichter gekleurd het eruit zal zien (meer licht doorgelaten).
Het competitief systeem is dus een omgekeerd systeem. Hoe meer onbekende (ongelabeld) je hebt, hoe
minder licht omdat je eigenlijk de plaatsen inpikt van het antigen met label.
- Concentratiebepaling door opstellen standaardcurve met gekende concentratie aan hetzelfde Ag
2
