Samenvatting theorie en practica moleculaire diagnostiek (notities, ppt, cursus, afbeeldingen)

Samenvatting moleculaire diagnostiek
1 Kwantitatieve PCR (qPCR)
1.1 Verschil tussen conventionele – en qPCR
Conventionele PCR qPCR
Detectie tijdens plateaufase, dus na afloop Detectie in real time: elke cyclus wordt de
PCR-reactie en meerdere cycli hoeveelheid PCR-product gemeten
Niet kwantitatief: veel variatie Kwantitatief


Kenmerken qPCR:

- Na of tijdens elke cyclus wordt gemeten hoeveel
PCR-product er is aangemaakt
- De PCR-producten zijn fluorescerend door binding
aan een fluorescente kleurstof of probe →
hoeveelheid fluorescentie ~ hoeveelheid van het
gevormde PCR-product

Voordelen qPCR:

- Het PCR-product moet na afloop van de reactie niet meer geanalyseerd worden
door bv. gelelektroforese → minder contaminatie doordat reactievaatje niet meer
geopend moet worden
- Mogelijkheid tot kwantificatie startmateriaal doordat hoeveelheid gevormd PCR-
product kan bepaald worden tijdens exponentiële fase
- Meerdere kleuren fluorescentie kunnen gedetecteerd worden → multiplex
toepassingen: meerdere targets in 1 reactie

Principe qPCR:

1. Denaturatie target
2. Anealing → binding primers
3. Extentie → aanmaak PCR-product en ontstaan
fluorescentiesignaal door:
▪ Binding fluorescerende DNA-bindende
kleurstoffen
▪ Afbraak hydrolisatieprobe
→ Elke cyclus zal er meer PCR-product en fluorescentie waarneembaar zijn:
o S-vormige curve
o Cyclus 1: weinig aanmaak en weinig fluorescentie
o Cyclus N: sterke toename hoeveelheid PCR-product en
fluorescentie → EXPONENTIËLE AMPLIFICATIE
o Cyclus 20-40: reactiecomponenten uitgeput en gevormde PCR-
producten remmen reactie → nauwelijks nog toename
hoeveelheid PCR-product en fluorescentie:
PLATEAUFASE

,1.2 Fluorescentie: detectie
Fluorochromen
= Moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen
1. Excitatie
2. Emissie: andere golflengte door verlies van een deel van de
energie

→ Opgelet: spectrale overlap
o Voor elk fluorochroom een kanaal met optimale golflengte
om te gaan meten
o Maxima mooi gescheiden
o Zo weinig mogelijk van een ander kanaal oppikken



1.3 Directe qPCR detectiemethoden
Door middel van fluorescerende DNA-intercallerende kleurstoffen (binden aan
dsDNA waardoor fluorescentie toeneemt):

- Ethidiumbromide (vroeger):
o Veel nadelen:
▪ Hoge achtergrondfluorescentie
▪ Mutageen
- SybrGreen (nu):
o Voordelen:
▪ Lagere achtergrondfluorescentie: ongebonden bijna geen
fluorescentie
▪ Voor elke PCR
o Nadelen:
▪ Niet specifiek: bindt ook ongewenste PCR-producten



1.4 Indirecte detectiemethoden
- Specifieker
- Enkel fluorescentie indien gebonden aan PCR-product door gebruik quencher
- 2 primers + probe (= gelabeld stukje ssDNA, complementair aan amplicon)



1.4.1 Hydrolyse probe, dual labelled probe of TaqMan probe
Principe:

1. Hybridisatie probe aan specifiek PCR-product
2. Extensie: door de 5’3’ exonucleaseactiviteit van Taq
DNA-polymerase wordt de probe afgebroken en
worden de nucleotiden 1 voor 1 verwijderd → toename
afstand tussen quencher en reporter/fluorochroom →
daling uitdovend effect → toename fluorescentie
→ Meting fluorescentie tijdens extentiefase
→ Soms binding MGB (minor groove binder) eiwit aan
3’-uiteinde:
o Binding versterkt: hogere Tm
o Kortere probes

, o Betere signaal-ruis verhouding
o Beter onderscheidend vermogen
o Tm probe gemakkelijk aanpassen



1.4.2 Molecular beacon probe
Principe:

1. Hairpin structuur via complementariteit waardoor quencher en reporter dicht bij
elkaar zitten
2. Anealing: hybridisatie obv complementariteit en energetisch gunstiger →
quencher en reporter verder uit elkaar → toename fluorescentie
3. Taq polymerase: verwijdeering probe (geen afbraak want geen vrij 5’ uiteinde) →
opnieuw hairpin structuur → geen fluorescentie
→ Meting fluorescentie tijdens anealing

Toepassingen: Multiplex toepassingen en mutatie-analyse

- Voordeel: zeer specifiek
- Nadeel: nauwkeurige bepaling dissociatie E maakt ontwerp moeilijk



1.5 Multiplex qPCR
Conventioneel:

- Verschillende fragmentlengtes
- Analyse via agarosegel

qPCR:

- Probes met verschillende fluorochromen
- Kleur ~ welk PCR-product is gesynthetiseerd
- 4 verschillende amplimeren → 4 verschillende primerparen → 4 verschillende
probes



1.5.1 Spectrale overlap emissiespectra
Spectrale overlap tussen fluorochromen:

Filters:

- Laten soms een beetje ander signaal door
- Overstralen: vals + resultaat

Fluorochromen scheiden obv emissie eigenschappen:

- Kalibratie
- Primers/probes niet complementair
- Gelijke Tm primers onderling
- Gelijke Tm probes onderling
- Tm 5-10°C > Tm primers

, 1.6 Genotyperen met molecular beacons
Molecular beacons:

- Zeer specifiek
- Speciaal ontwikkeld voor SNV-analyse
- Geen signaal indien geen 100% overeenkomst met target DNA: door hairpin
structuur vouwt de probe zich terug op indien deze niet voor 100% past
- 2 beacons nodig: 1 complementair aan ene allel en een aan andere allel




1.7 Detectie, analyse en kwantificering van qPCR-producten
1.7.1 Drempelwaarde (treshold) en Cq waarde
Treshold:

- Niveau vanaf waar alles als positief beschouwd wordt
- Grens tussen achtergrondfluorescentie en
fluorescentie door ontstaan PCR-producten

Cq:

- Cyclus waarbij staal positief wordt
- Waar drempelwaarde en PCR-amplificatiecurve
elkaar snijden
- Hoe lager de Cq, hoe meer target materiaal en
hoe minder cycli nodig



1.7.2 Efficiëntie qPCR
Afhankelijk van:

- Remmende stoffen of inhibitoren zoals ethanol, heparine, …
- Lengte target
- Secundaire structuur (hairpin) target
- Beschikbare PCR-componenten
→ Door bepalen efficiëntie: variabelen optimaliseren en effect verschillende
variabelen bepalen

Bepalen efficiëntie:

Standaardcurve 10-voudige verdunningen: