Samenvatting microbiologie 2

H1 : KLASSIEKE EN ALTERNATIEVE
DETECTIEMETHODEN


1.1. ISO-METHODEN EN KLASSIEKE CULTUURMETHODE



ISO = International Standardisation for Organisation
 Erkend als referentie methoden voor officiële controles
 Gebaseerd op de klassieke cultuurmethode: selectieve media voor groeien, isoleren
en tellen
van doelwitorganisme
 Ontwikkeld op basis van expertise
 Open acces methoden: samenstelling van medium vrij beschikbaar, technieken
beschreven




1. KLASSIEKE CULTUURMETHODE (KWEEKMETHODE)

1) Vooraanrijking
- Op niet-selectief of half-selectief medium
- Herstel van gestresseerde m.o. teweegbrengen (groei alle bacteriën)
2) Aanrijking
- Op selectief medium
- Competitieve flora geïnhibeerd: groei van doelwitorganisme
- Zouten toevoegen
3) Isolatie
- Op selectief differentiërend medium
4) Bevestigende testen

Algemeen: De detectie van klassieke cultuurmethode berust op het vermogen van een
m.o. om zich onder geschikte omstandigheden te vermenigvuldigen tot aantallen die
waarneming mogelijk maken.

Selectief = medium met optimale groeiomstandigheden voor een bepaalde bacterie

Differentiërend = indicatoren toevoegen om verwant te zien (vb pH)

 1-4 dagen of 5-7 dagen
 Modificaties mogelijk om sneller te gaan (differentiële media gebruiken)
 Eenvoudige kits/minisystemen voor bevestiging (API)

,API strip:

- Gedroogd substraat in kleine cupjes
- Resultaat via applicatie ingeven en resultaat berekenen
- Identificatie/bevestiging op species niveau
- Voordeel: geen verschillende VB aanmaken, onmiddellijk 20 testen
- Strip incuberen na enten




1.2. ALTERNATIEVE METHODEN

• Voordeel klassiek: geen dure infrastructuur
• Nadeel klassiek: arbeidsintensief, grote volumes media en tijdrovend
• Snelle methode: kortere tijd tot detectie + automatisatie
• Alternatieve methode: analyse van meerdere stalen tegelijk (= automatisatie)
• 4 soorten:
- Chromogene VB
- Immunologische methode
- Moleculaire methode
- Massa spectrometrie (MS)

1. CHROMOGENE VOEDINGSBODEM

• Determineren bacteriën: aantonen van enzymatische activiteit nodig
• Op agarplaat: specifiek bacterieel enzym aangetoond door omzetting van
toegevoegde substraat
• Kolonies/bodem veranderen van kleur
• Bij conventionele VB: pH-gevoelige indicator
• Bij chromogene VB: chromogene substraten
- Chromogeen deel afgesplitst door enzym in doelwitorganisme
- Kleurverandering/Fluorescentie
- Verdere biochemische testen geëlimineerd
- Determineren verloopt sneller en goedkoper
- Bevestigende test aanbevolen
• Salmonella, E.coli, coliformen, L.monocytogenes …




2. IMMUNOLOGISCHE METHODEN

Antigenen = deeltjes van bacteriën waartegen antistoffen gevormd kunnen
worden

,  H-antigenen: eiwitten van flagellen
 O-antigenen: deeltjes van celwand
 K-antigenen: deeltjes van slijmlaag



• Gebaseerd op specifieke binding tussen antilichamen en antigenen
• Vervangt stap 3 (isolatie)
• Stap 3: gebruik gemaakt van specificiteit antigen-antilichaam (sneller)
• Verschillende immunoassays: ELISA en Agglutinatie test



Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISAs)
 Immunoassay gecombineerd met enzym assay
 Sandwich ELISA:
1. Specifieke AL gecoat op een cupje
2. Staal toevoegen + binden op AL
3. AL specifiek tegen AG toevoegen
4. Substraat toevoegen: omgezet door enzym op AL  signaal
 Signaal: maat voor hoeveelheid antigen aanwezig is




 In de vorm van geautomatiseerde systemen
- Minder arbeidsintensief
- Verbeteren de reproduceerbaarheid en standaardisatie van elke stap
 VIDAS: Salmonella, Listeria spp., L.monocytogenes, E.coli, Campylobacter
spp., Staphylococcus enterotoxines A tot E

Agglutinatie test
 Gebaseerd op interactie antilichamen en antigenen
 Vervangt stap 4 (bevestigende test)
 S.aureus: m.o. heeft rol van antigen
 Antigen aanwezig: AL reageert met AG door agglutinatie
- Door cross-linking tussen AG en AL

,  Soms gevolgd door serologische test
- Antigenische kenmerken bepalen
- O- of H-antigenen aanwezig: agglutinatie in contact met AL
- Serotype bepalen van Salmonella en E.coli
 Voorbeeld: Staphytect

3. MOLECULAIRE METHODEN

• Gebaseerd op genetisch materiaal van m.o. (DNA of RNA)
• Maken gebruik van mogelijkheid om 2 enkelstrengige DNA-moleculen in vitro te
hybridiseren

Hybridiseren = koppelen van 2 complementaire strengen DNA tot dubbelstrengig DNA

Polymerase Chain Reaction (PCR)

 DNA kopiëren in testbuisje
 Mogelijk om grote hoeveelheid van klein stukje DNA (=target) te maken
 Enzym: DNA polymerase (kopieert DNA streng)
 Primers: specificeert de regio/target dat gekopieerd moet worden

Primer = korte oligonucleotide waarvan sequentie complementair is met einde van
targetregio

3 stappen:

1. DNA gedenatureerd: verhitting van 95°C splitst 2 strengen
2. Temperatuur ↓ tot 65°C + primers toevoegen: 1 op begin en 1 op einde andere
streng
3. Temperatuur ↑ tot 72°C + enzym polymerase toevoegen met aantal nucleotiden:
complementaire streng geproduceerd, opnieuw dubbelstrengig DNA




 Meerdere cyclussen: exponentiële verhogen kopieën
 Resultaat: gevisualiseerd door agarose gel elektroferese en kleuring
 Real-time PCR: variant (ook kwantificatie)
 30-90 minuten
 Stap 1 en 2 nog nodig
 Toegankelijkheid verhoogd: standaardisatie, gebruiksvriendelijk en software
 Positief resultaat: klassieke cultuurmethode ter bevestiging
 Voor detectie van Salmonella, L.monocytogenes en E.coli O157