CELCULTUUR:
FLOWCYTOMETRIE
Academiejaar 2018-2019
Bronnen:
Deze samenvatting is gebaseerd op de PowerPoint’s en lessen van Prof. dr. Nathalie Cools
Afbeeldingen afkomstig uit de PowerPoint’s van Prof. dr. Nathalie Cools
,LES 1
Enkele begrippen
- PARAMETER (verschillende betekenissen)
o Fysische of chemische eigenschappen van een cel
Cytoplasmic granularity or nuclear DNA content
o Fysische eigenschap, gemeten door een sensor
Light scattering or fluorescence
o Fysische eigenschap van een cel-geassocieerd reagens
Intrinsic/Extrinsic, afhankelijk of ze als dan niet gemeten kunnen met sonde
- EXCITATIE
o Proces waarbij optische energie geabsorbeerd wordt
- EXTINCTIE COEFFICIENT (ε)
o Efficiëntie waarmee optische energie geabsorbeerd wordt (afhankelijk v golflengte)
- EMISSIE
o Proces waarbij optische energie terug vrijgesteld wordt
- QUANTUM OPBRENGST(Q)
o Efficiëntie waarmee energie wordt vrijgesteld (0-1), meestal als fluorescentie
o Onafhankelijk van golflengte
- STOKES SHIFT
o Verschil in energie tussen excitatie en emissie golflengte max
- SPECTRUM
o Verdeling van excitatie en emissie golflengtes
Flow cytometrie - definitie
- Analyse van het woord:
o Flow = vloeistof
o Cyto = cel
o Metrie = meten
- Cytometry => fysische & chemische eigenschappen van cellen meten
- Flow cytometrie => hierbij worden metingen uitgevoerd terwijl cellen in een vloeistofsuspensie 1 voor 1
voorbij het meettoestel passeren
- Gebruik van flowcytometrie:
o Informatie over een celpopulatie verkrijgen
o + de verschillen in fysische & chemische eigenschappen tussen de cellen (=> de PARAMETERS)
o Gebeurt aan de hand van optische eigenschappen
- Flowcytometer (ruwe schets)
o Ruwe schets van wat er gebeurd:
Cellen in suspensie stromen als individuele partikels (1 voor 1) langs de laser (1 of meerdere
lasers)
Cellen gaan doorheen interrogatieunt (= waar laser de vloeistofstroom kruist)
o Belangrijk:
Cellen moeten een single cel suspensie vormen => 1 voor 1 lang de lichtbron
Cellen in die stroom brengen vereist hydrodynamische focussering
Individuele cellen verkrijgen
- Cellen/partikels in oplossing moeten erg klein zijn (0,2-150 um)
o Witte BC zijn bijvoorbeeld erg geschikt voor FCM
o Minder handig: biopten & tumorstalen
Hier: extra verwerkingsprocedure nodig (enzymatisch/mechanisch cellen dissociëren)
1
, Bouw flowcytometer
- Bevat steeds 3 delen
- Vloeistofsysteem (fluidics):
o = tank met vloeistof
o Zorgt voor transport van partikels/cellen in
vloeistofstroom naar de laser
- Optisch systeem (optics):
o Bestaat uit de laser -> aanstraling/excitatie van de
partikels
o Optische filters -> lichtsignaal naar juiste detector leiden
- Elektronica
o Zet lichtsignaal om in meetbaar elektronisch signaal
o Elektronisch signaal gaat verwerkt worden door de pc
Vloeistofsysteem
- Belangrijkste functie = transport van partikels
- 3 delen
o Sheath tank met geleidingsvloeistof
Zorgt voor hydrodynamische focussering
o Sample tube
o ‘Flow cell’
= hart van de flowcytometer
Daar: hydrodynamische focussering
- Druk:
o Druk sample hoger dan druk geleidingsvloeistof
o Druk op staal zelf ook groter dan druk op tank
- Optimale aanstraling gebeurt als:
o Celsuspensiestroom centraal in de laser ligt
o Maar 1 partikel/cel doorheen de laser gaat
- 2 belangrijke zaken zorgen ervoor dat cellen 1 voor 1 vloeien voorbij laser:
o Laminaire flow
o Hydrodynamische focussering
- Hydrodynamische focussering
o Doel = juiste oriëntatie van cel t.o.v. meetapparaat krijgen
Zorgt dat cellen 1 voor 1 aangestraald zullen
worden
o “Een hoog volume van het sample wordt in kleine
volume geforceerd in de flow cell”
Celsuspensie wordt “gespoten” in de
geleidingsvloeistof
Celsuspensie gaat in 1 rechte straal gaan
o Voorwaarde = laminaire stroom
Enkel als beide laminaire stroom hebben kan
je een vloeistof in een andere injecteren & gaan de vloeistoffen niet mengen
Wordt verkregen dankzij drukverschil in tube & tank
o Geleidingsvloeistof heeft grotere snelheid
Zorgt dat cellen 1 voor 1 zullen vloeien
Versnelt de suspensie -* partikels/cellen beperkt tot de centrale ruimte
- stroom laminair of turbulent? => getal van Reynolds:
o Formule: Re = d ρ v / η
d = diameter tube, ρ = vloeistofdensiteit, v = vloeistofsnelheid, η = viscositeit
o Bij Re < 2300 => laminaire stroom
2
FLOWCYTOMETRIE
Academiejaar 2018-2019
Bronnen:
Deze samenvatting is gebaseerd op de PowerPoint’s en lessen van Prof. dr. Nathalie Cools
Afbeeldingen afkomstig uit de PowerPoint’s van Prof. dr. Nathalie Cools
,LES 1
Enkele begrippen
- PARAMETER (verschillende betekenissen)
o Fysische of chemische eigenschappen van een cel
Cytoplasmic granularity or nuclear DNA content
o Fysische eigenschap, gemeten door een sensor
Light scattering or fluorescence
o Fysische eigenschap van een cel-geassocieerd reagens
Intrinsic/Extrinsic, afhankelijk of ze als dan niet gemeten kunnen met sonde
- EXCITATIE
o Proces waarbij optische energie geabsorbeerd wordt
- EXTINCTIE COEFFICIENT (ε)
o Efficiëntie waarmee optische energie geabsorbeerd wordt (afhankelijk v golflengte)
- EMISSIE
o Proces waarbij optische energie terug vrijgesteld wordt
- QUANTUM OPBRENGST(Q)
o Efficiëntie waarmee energie wordt vrijgesteld (0-1), meestal als fluorescentie
o Onafhankelijk van golflengte
- STOKES SHIFT
o Verschil in energie tussen excitatie en emissie golflengte max
- SPECTRUM
o Verdeling van excitatie en emissie golflengtes
Flow cytometrie - definitie
- Analyse van het woord:
o Flow = vloeistof
o Cyto = cel
o Metrie = meten
- Cytometry => fysische & chemische eigenschappen van cellen meten
- Flow cytometrie => hierbij worden metingen uitgevoerd terwijl cellen in een vloeistofsuspensie 1 voor 1
voorbij het meettoestel passeren
- Gebruik van flowcytometrie:
o Informatie over een celpopulatie verkrijgen
o + de verschillen in fysische & chemische eigenschappen tussen de cellen (=> de PARAMETERS)
o Gebeurt aan de hand van optische eigenschappen
- Flowcytometer (ruwe schets)
o Ruwe schets van wat er gebeurd:
Cellen in suspensie stromen als individuele partikels (1 voor 1) langs de laser (1 of meerdere
lasers)
Cellen gaan doorheen interrogatieunt (= waar laser de vloeistofstroom kruist)
o Belangrijk:
Cellen moeten een single cel suspensie vormen => 1 voor 1 lang de lichtbron
Cellen in die stroom brengen vereist hydrodynamische focussering
Individuele cellen verkrijgen
- Cellen/partikels in oplossing moeten erg klein zijn (0,2-150 um)
o Witte BC zijn bijvoorbeeld erg geschikt voor FCM
o Minder handig: biopten & tumorstalen
Hier: extra verwerkingsprocedure nodig (enzymatisch/mechanisch cellen dissociëren)
1
, Bouw flowcytometer
- Bevat steeds 3 delen
- Vloeistofsysteem (fluidics):
o = tank met vloeistof
o Zorgt voor transport van partikels/cellen in
vloeistofstroom naar de laser
- Optisch systeem (optics):
o Bestaat uit de laser -> aanstraling/excitatie van de
partikels
o Optische filters -> lichtsignaal naar juiste detector leiden
- Elektronica
o Zet lichtsignaal om in meetbaar elektronisch signaal
o Elektronisch signaal gaat verwerkt worden door de pc
Vloeistofsysteem
- Belangrijkste functie = transport van partikels
- 3 delen
o Sheath tank met geleidingsvloeistof
Zorgt voor hydrodynamische focussering
o Sample tube
o ‘Flow cell’
= hart van de flowcytometer
Daar: hydrodynamische focussering
- Druk:
o Druk sample hoger dan druk geleidingsvloeistof
o Druk op staal zelf ook groter dan druk op tank
- Optimale aanstraling gebeurt als:
o Celsuspensiestroom centraal in de laser ligt
o Maar 1 partikel/cel doorheen de laser gaat
- 2 belangrijke zaken zorgen ervoor dat cellen 1 voor 1 vloeien voorbij laser:
o Laminaire flow
o Hydrodynamische focussering
- Hydrodynamische focussering
o Doel = juiste oriëntatie van cel t.o.v. meetapparaat krijgen
Zorgt dat cellen 1 voor 1 aangestraald zullen
worden
o “Een hoog volume van het sample wordt in kleine
volume geforceerd in de flow cell”
Celsuspensie wordt “gespoten” in de
geleidingsvloeistof
Celsuspensie gaat in 1 rechte straal gaan
o Voorwaarde = laminaire stroom
Enkel als beide laminaire stroom hebben kan
je een vloeistof in een andere injecteren & gaan de vloeistoffen niet mengen
Wordt verkregen dankzij drukverschil in tube & tank
o Geleidingsvloeistof heeft grotere snelheid
Zorgt dat cellen 1 voor 1 zullen vloeien
Versnelt de suspensie -* partikels/cellen beperkt tot de centrale ruimte
- stroom laminair of turbulent? => getal van Reynolds:
o Formule: Re = d ρ v / η
d = diameter tube, ρ = vloeistofdensiteit, v = vloeistofsnelheid, η = viscositeit
o Bij Re < 2300 => laminaire stroom
2
