Samenvatting Hoofdstuk 8: Modulatie van genexpressie. Studenten cursus

Hoofdstuk 8: Modulatie van genexpressie


Genexpressie moduleren op verschillende niveaus (DNA wijzigen, inwerken op RNA of rechtstreeks
inwerken op het eiwit om deze af te breken)  doel:
 Functie en rol van eiwitten in fysiologie en pathologie bestuderen (bv in een ziektebeeld)
 Doelwitten (eiwitten of genen) identificeren voor ontwikkelen van medicijnen die functie van
genproducten moduleren
Overzicht:




1. Onderdrukking van genexpressie via antisense technologie
Principe:
 Gebaseerd op Watson-Crick base paring met mRNA sequentie (hybridisatie met DNA/RNA) 
zuiver en specifiek
 Twee verschillende methodologiën:
o ASO: AntiSense Oligonucleotiden  single strand oligo
o RNAi: RNA interferentie

1.1. Antisense oligonucleotiden (ASO) (ssDNA)
 Kort (8-50nt) enkelstrengig DNA (ssDNA)
 Gericht tegen mRNA van gen waarvan men expressie wil down moduleren (inhiberen)
 Basis: Vorming van stabiel RNA/DNA duplex
 Resultaat: Onderdrukking/modulering van genexpressie via 3 complementaire mechanismen:
o Dus 3 mechanismen en 2 methoden
o Approach 1:
 Pre-mRNA = mRNA in de nucleus  sequentie richten naar het poly-A-signaal van het
specifieke gen of tegen splicing acceptor sites
 Poly-A: pre-mRNA heft geen poly-A  degradatie
 Splicing: exonen overslaan (om ziektebeeld bv op te lossen)  degradatie
 Vb van therapie: eteplirsen: gericht tegen DMD gen dat codeert voor dystrofine
o Approach 2 : op niveau van mature mRNA:
 (a) RNase-H-afhankelijke target mRNA degradatie (vb fomivirsen – CMV retinitis)
(afbraak tot gevolgd) (DUS: oligo tegen mRNA  hybride  afbraak door RNase H)

74

,  (b) blockage van ribosome binding site, 5’ cap site, translatie initiatie site (geen
translatie tot gevolg) (DUS: Oligo richten tegen functionele domeinen bv 5’ cap  ook
geen vertaling naar eiwit


Barrières voor toepassing van de oligo’s:
 Opname in de cel en
weefseldistributie (wordt niet
gemakkelijk opgenomen)
o  betere opname door:
o Chemische modificaties bv
cholesterol aanhangen om
opname te verhogen of
fusioneren met een cell-
penetrating peptide
o Inkapselen in nanopartikels
 Stabiliteit: afbraak door nucleases
(kunnen gemakkelijk hun activiteit
verliezen)
o Chemische modificaties: in
fosfaatgroep, suiker, base 
stabieler maken
 Toxiciteit
Dus 3 nadelen: zorgen dat ze in de cel
geraken, snelle afbraak in de cel, toxisch
1.2. RNAi = RNA interface
 RNA interferentie is het proces waarbij de expressie van een doelwitgen onderdrukt wordt door de
selectieve inactivatie van het mRNA door dsRNA
 dsRNA wordt geprocessed tot ssRNA dat dan kan base-paren met het doelwit mRNA (ssRNA is dan
complementair met het doelwit)
 Gebruik maken van proces dat reeds natuurlijk voorkomt in cellen (zie ook miRNA)
 2 methoden voor RNAi technologie:




Mechanisme van RNA Interferentie
A. Endogene miRNA silencing pathway (doel: genexpressie gericht moduleren)
a. In cytoplasma wordt het pre-miRNA herkend door het nuclease dicercomplex  knipt het pre-
miRNA in een dsRNA van ongeveer 20-22 nucleotiden
b. Dit dsRNA wordt herkend door het RISC-complex en AGO2 (RNA Induced Silencing Complex en
AGO2 = arganaut is een soort RNase)
c. 1 van de 2 strands wordt afgebroken (= passenger strand), daarna vormt zich een complex van
ssRNA (guide strand) met het RISC- en AGO2 complex
d. Dit ssRNA gaat complementair zijn met stukken van het mRNA en hiermee hybridiseren 
eiwitcomplex zit nu op het mRNA
e.  translatie van het mRNA wordt hierdoor geblokkeerd
f. Note: de 1ste 8 nt zijn belangrijk voor de hybridisatie, niet alle 20-22  hierdoor kan 1 miRNA
verschillende mRNA’s van verschillende genen gaan downreguleren


75

, B. 20 nucleotides van dsRNA gericht tegen een gen in de cel brengen
a. Zelfde proces als bij het miRNA
b. Optie 1: siRNA van 20 nt  Dicer moet niet meer knippen
c. Optie 2: siRNA lander dan 20 nt  Dicer knipt wel
d. Verschil met endogene pathway (miRNA): door specifieke design zorg je ervoor dat de 20
nucleotiden perfect matchen met het mRNA dat je wilt down reguleren
e.  AGO2 gaat hierdoor het mRNA in 2 knippen <-> miRNA: translatie blokkeert  degradatie
in P-bodies

A



B




siRNA:
 Commercieel verkrijgbaar: custom of pre-
designed, al dan niet gevalideerd
(alternatief: in vitro transcriptie)
 Accumuleren voornamelijk in cytoplasma
 Knock-down van het RNA is transiënt
(gaat dus terug weg, daarna weer eiwitexpressie)
 Delivery: verschillende methoden
 Nadelen:
o Off-target effecten door interactie met natuurlijke miRNA pathways  als de seed region (8 nt)
overeen komt met een andere mRNA  miRNA effect kan dus ook andere mRNA’s / genen
downreguleren
o Immuunstimulatie = 2de off-target effect: patroon recognition receptoren in het aangeboren
immuunsysteem bv TLR  gaan verschillende patronen herkennen  TLR7 is hier van belang,
herkent dsRNA: voorkomen door minder G en U’s in de sequentie te steken
o Stabiliteit: onderhevig aan afbraak door nucleases
 Oplossingen  verminderen van de off-target effecten:
o Chemische modificaties van siRNA om ze stabieler te maken (in fosfaatgroep, ribose of base)
 Single streng overhangs zijn gevoelig voor degradatie  fosfothiodaat backbone
gebruiken
 Methoxy op de 2’ vd base  zorgt voor zowel minder immuunstimulatie als minder
off-target effecten
76