H10: DNA TECHNOLOGIE
10.1 FRAGMENTEREN VAN DNA
Observatie: bacteriën kunnen getransformeerd (= veranderd) worden doordat ze DNA uit de
omgeving kunnen opnemen
➔ geldt NIET voor elk DNA;
o DNA van bepaalde bacteriestammen werd dadelijk na opname afgebroken
o DNA van andere bacteriestammen bleef intact
➔ Er was een restrictie op het ‘soort’ DNA dat tot transformatie kon leiden
= aanwezigheid van endonucleasen die ‘vreemd’ DNA herkennen en afbreken
Endonucleasen = restrictie-enzymen: hydrolyseren de fosfodiesterbinding in de ruggegraat v/d
DNA keten en doen dit midden in een DNA fragment (i.t.t. de exonucleasen)
Restrictie-enzymen herkennen korte palindromische sequenties (4, 6-8 bp.) en knippen in of in de
omgeving van deze sequenties
➔ Meeste restrictie-enzymen knippen symmetrisch in de 2 DNA strengen v/d DNA dubbele
helix
➔ Na restrictie ontstaan ofwel blunt end uiteinden, ofwel 5’ overhangende uiteinden ofwel 3’
overhangende uiteinden
,Herkenningssequenties = restrictie-sites
→ restrictie-enzymen worden genoemd naar het organisme waaruit ze zijn afgezonderd
vb. EcoRI werd afgezonderd uit de E. coli stam R en kreeg het nummer I
Groot aantal restrictie-enzymen
→ het eigen DNA van de bacterie wordt beschermd tegen de restrictie-enzymen doordat de
bacteriën naast de restrictie-enzymen ook steeds een 2de enzyme bevatten dat specifieke basen in
de herkenningssites methyleert → deze sequentie kan niet meer herkend worden door de eigen
restrictie-enzymen
Met restrictie-enzymen lange DNA moleculen op reproduceerbare wijze fragmenteren
→ complexiteit v/h DNA wordt drastisch verminderd
RESULTAAT = dat 1 bepaald gen (en ook het hele genoom) steeds op dezelfde manier zal geknipt
worden → electroforese uitvoeren van dit geknipte genomische DNA → deze fragmenten zullen
gescheiden worden volgens lengte; het specifieke gen (of alle DNA fragmenten die het bevatten)
zal na de electroforese op een welbepaalde positie in de gel terechtgekomen zijn
, 10.2 TERUGVINDEN VAN EEN SPECIFIEK DNA FRAGMENT
Identificatie en isolatie v/h DNA fragment dat ons interesseert (bv. gen, enhancer, promotor, ORI)
→ gebruik maken v/d eigenschap dat DNA kan gedenatureerd worden en dat complementaire
DNA fragmenten kunnen hybridiseren
- Denatureren = het uit mekaar halen v/d 2 (complementaire) DNA strengen v/d dubbele
helix door de waterstofbruggen te breken
- Hybridiseren = het vormen van een dubbele DNA helix uit 2 enkelstrengige
complementaire nucleïnezuren (of RNA)
→ DNA fragment radioactief of fluorescent merken
→ na hybridisatie kan men het complementaire fragment in de gel lokaliseren
o Gemerkte fragment = probe
10.3 KLONEN VAN DNA FRAGMENTEN
10.3.1 PLASMIDEN
Plasmiden = minichromosomen die bij sommige bacteriën worden teruggevonden als
extrachromosomale, kleine, circulaire, dubbelstrengige DNAs
Plasmide moet een ORI bevatten om replicatie toe te laten (gaat anders verloren bij snelle
delingen v/d bacteriën) + een selectieve merker ( = gen dat codeert voor een bepaald voordeel
voor de gastheer; indien geen voordeel aan het dragen van plasmide zal dit snel verdwijnen)
Plasmiden gebruiken bij kloneren: reeks restrictie-sites naast elkaar inbrengen
→ leidt tot een ‘multiple cloning site’ of ‘polylinker’ → hierdoor kan men restrictiefragmenten van
verschillende kloneringsprojecten makkelijk in hetzelfde plasmide kloneren
10.1 FRAGMENTEREN VAN DNA
Observatie: bacteriën kunnen getransformeerd (= veranderd) worden doordat ze DNA uit de
omgeving kunnen opnemen
➔ geldt NIET voor elk DNA;
o DNA van bepaalde bacteriestammen werd dadelijk na opname afgebroken
o DNA van andere bacteriestammen bleef intact
➔ Er was een restrictie op het ‘soort’ DNA dat tot transformatie kon leiden
= aanwezigheid van endonucleasen die ‘vreemd’ DNA herkennen en afbreken
Endonucleasen = restrictie-enzymen: hydrolyseren de fosfodiesterbinding in de ruggegraat v/d
DNA keten en doen dit midden in een DNA fragment (i.t.t. de exonucleasen)
Restrictie-enzymen herkennen korte palindromische sequenties (4, 6-8 bp.) en knippen in of in de
omgeving van deze sequenties
➔ Meeste restrictie-enzymen knippen symmetrisch in de 2 DNA strengen v/d DNA dubbele
helix
➔ Na restrictie ontstaan ofwel blunt end uiteinden, ofwel 5’ overhangende uiteinden ofwel 3’
overhangende uiteinden
,Herkenningssequenties = restrictie-sites
→ restrictie-enzymen worden genoemd naar het organisme waaruit ze zijn afgezonderd
vb. EcoRI werd afgezonderd uit de E. coli stam R en kreeg het nummer I
Groot aantal restrictie-enzymen
→ het eigen DNA van de bacterie wordt beschermd tegen de restrictie-enzymen doordat de
bacteriën naast de restrictie-enzymen ook steeds een 2de enzyme bevatten dat specifieke basen in
de herkenningssites methyleert → deze sequentie kan niet meer herkend worden door de eigen
restrictie-enzymen
Met restrictie-enzymen lange DNA moleculen op reproduceerbare wijze fragmenteren
→ complexiteit v/h DNA wordt drastisch verminderd
RESULTAAT = dat 1 bepaald gen (en ook het hele genoom) steeds op dezelfde manier zal geknipt
worden → electroforese uitvoeren van dit geknipte genomische DNA → deze fragmenten zullen
gescheiden worden volgens lengte; het specifieke gen (of alle DNA fragmenten die het bevatten)
zal na de electroforese op een welbepaalde positie in de gel terechtgekomen zijn
, 10.2 TERUGVINDEN VAN EEN SPECIFIEK DNA FRAGMENT
Identificatie en isolatie v/h DNA fragment dat ons interesseert (bv. gen, enhancer, promotor, ORI)
→ gebruik maken v/d eigenschap dat DNA kan gedenatureerd worden en dat complementaire
DNA fragmenten kunnen hybridiseren
- Denatureren = het uit mekaar halen v/d 2 (complementaire) DNA strengen v/d dubbele
helix door de waterstofbruggen te breken
- Hybridiseren = het vormen van een dubbele DNA helix uit 2 enkelstrengige
complementaire nucleïnezuren (of RNA)
→ DNA fragment radioactief of fluorescent merken
→ na hybridisatie kan men het complementaire fragment in de gel lokaliseren
o Gemerkte fragment = probe
10.3 KLONEN VAN DNA FRAGMENTEN
10.3.1 PLASMIDEN
Plasmiden = minichromosomen die bij sommige bacteriën worden teruggevonden als
extrachromosomale, kleine, circulaire, dubbelstrengige DNAs
Plasmide moet een ORI bevatten om replicatie toe te laten (gaat anders verloren bij snelle
delingen v/d bacteriën) + een selectieve merker ( = gen dat codeert voor een bepaald voordeel
voor de gastheer; indien geen voordeel aan het dragen van plasmide zal dit snel verdwijnen)
Plasmiden gebruiken bij kloneren: reeks restrictie-sites naast elkaar inbrengen
→ leidt tot een ‘multiple cloning site’ of ‘polylinker’ → hierdoor kan men restrictiefragmenten van
verschillende kloneringsprojecten makkelijk in hetzelfde plasmide kloneren
