Immunologie werkzitting
In labo: wat heb je nodig en hoe kan je eraan geraken
Vraagstelling:
Hoe kunnen humane monocyten/macrofagen na infectie bij een patiënt de antimicrobiële respons
versterken door neutrofiele granulocyten aan te trekken om de infectie te bestrijden?
Antwoord: In vitro methode voor dit na te gaan:
Met of zonder gebruik van m-o
Materiaal nodig voor experiment op te starten
1) Macrofagen en monocyten zuiveren:
uit humaan bloed (zitten in bloedbaan)
(bloedstaal bevat RBC, bloedplaatjes, plasma en WBC (monocyten))
=> zuivere monocyten
2) Je wil zien wat er bij antimicrobiële respons gebeurt: stof toevoegen voor stimuleren
Optie 1: MET gebruik m-o: toevoegen levende bacterie of virus aan monocyten
Optie 2: ZONDER gebruik m-O
G- bact: LPS toevoegen vs G+ bact: peptidoglycaan, flagelline vs virussen: dsRNA
=> liganden voor de tol-like-R
3) Je wil neutrofielen aantrekken => dit kan door chemokinen
=> dit moeten de monocyten produceren
Extra: bij muis:
kan macrofagen via peritoneum afnemen => hier zitten veel macrofagen
+: je kan in vivo werken: echte infectie van de muis: in het organisme doen)
Hoe bekom je de cellen en wat ga je er mee doen?
1. Zuiveren monocyten
Optie 1 : Isolatie PBMCs uit bloed:
=> werk met WBC, NK cellen, lymfo- en monocyten
1) Medium nemen bv. ficoll
2) Pipeteer hierop bloed
3) Centrifugeer 30min => °scheiding: onder RBC – granulocyten (zie je niet: zijn minder dan RBC)
– medium – witte band met PBMCs (WBC: lymfo- en monocyten, NK cellen) – plasma
1
, Optie 2 : zuiveren specifiek monocyten
=> dmv flowcytometrie cel per cel sorteren (langs laser) => traag)
dmv magnetische beads (snel)
positieve selectie: Ab’s tegen monocyten op magnetische beads bv. CD14
nadeel: kan dat beads een effect hebben op je mole
negatieve selectie: 1e zuiveren PBMC’s, dan gebruik Ab’s tegen lymfocyten en NK cellen
=> enkel monocyten lopen door (+: geen effect v/d beads)
Inductie experiment:
Kweek de cellen (monocyten) met bepaalde celconcentratie in 24 well plaat in groeimedium
=> incuberen cellen: 37°C (humane cellen), foetaal kalfsserum (met GF),
zoutoplossing (geen osmotische shok); buffer: CO2 incubator (stabiele pH) (24-48u)
=> toevoegen verschillende stoffen => stimuleren monocyten:
TLR liganden (G+, G-, virus)/cytokinen => microbiële respons
=> Cytokine 8 (IL8) (meest gemaakt door monocyten en meest actief) vrijgezet door monocyten
=> meet hoeveelheid geïnduceerd chemokine in bovenstaande vloeistof (na centrifugatie) met
immunologische test
2. Immunologische test gebruiken voor concentratie IL-8/ CXCL8
bepalen
Concentratie IL8 bepalen
welke test?:
ELISA (meest effectief), RIA, (in cyto kijken of IL-8 productie)
western blot (moeilijk voor juiste conc. bepalen, +: je ziet ook MW van eiwit)
maak schema met verschillende stappen (zie slide 11-14)
maak lijst met nodige materiaal en reagentia
hoe bekom je de reagentia?
Reagentia nodig voor de immunologische test: Ab’s nodig
Ab’s maken:
- Polyklonale Ab maken:
w gesecreteerd door meerdere klones Ag-specifieke B cellen
Immuniseer konijn meerdere x’en met Ag
met adjuvans (alum, CFA, poly I:C => sterkere respons)
=> proefdier bloed afnemen => Ab’s uit serum zuiveren: bloed laten stollen (cellen in stolsel)
=> °zuiver serum => affiniteitschromatografie:
ofwel covalent Ag (IL8) op kolom zetten (maar is duur, wel zeer specifiek)
ofwel matrix met proteïne A of G op kopen (alle Ab’s zullen binden => crossreactie,…)
voordeel: kan meerdere keren bloed nemen van 1 muis, Ab’s tegen ≠ epitopen,
polyklonaal Ab => agglutinatie en neerslag (immunoprecipitatie)
nadeel: ≠ bloedingen => Ab’s met ≠ affiniteit, crossactiviteit tgn ander Ag
2
In labo: wat heb je nodig en hoe kan je eraan geraken
Vraagstelling:
Hoe kunnen humane monocyten/macrofagen na infectie bij een patiënt de antimicrobiële respons
versterken door neutrofiele granulocyten aan te trekken om de infectie te bestrijden?
Antwoord: In vitro methode voor dit na te gaan:
Met of zonder gebruik van m-o
Materiaal nodig voor experiment op te starten
1) Macrofagen en monocyten zuiveren:
uit humaan bloed (zitten in bloedbaan)
(bloedstaal bevat RBC, bloedplaatjes, plasma en WBC (monocyten))
=> zuivere monocyten
2) Je wil zien wat er bij antimicrobiële respons gebeurt: stof toevoegen voor stimuleren
Optie 1: MET gebruik m-o: toevoegen levende bacterie of virus aan monocyten
Optie 2: ZONDER gebruik m-O
G- bact: LPS toevoegen vs G+ bact: peptidoglycaan, flagelline vs virussen: dsRNA
=> liganden voor de tol-like-R
3) Je wil neutrofielen aantrekken => dit kan door chemokinen
=> dit moeten de monocyten produceren
Extra: bij muis:
kan macrofagen via peritoneum afnemen => hier zitten veel macrofagen
+: je kan in vivo werken: echte infectie van de muis: in het organisme doen)
Hoe bekom je de cellen en wat ga je er mee doen?
1. Zuiveren monocyten
Optie 1 : Isolatie PBMCs uit bloed:
=> werk met WBC, NK cellen, lymfo- en monocyten
1) Medium nemen bv. ficoll
2) Pipeteer hierop bloed
3) Centrifugeer 30min => °scheiding: onder RBC – granulocyten (zie je niet: zijn minder dan RBC)
– medium – witte band met PBMCs (WBC: lymfo- en monocyten, NK cellen) – plasma
1
, Optie 2 : zuiveren specifiek monocyten
=> dmv flowcytometrie cel per cel sorteren (langs laser) => traag)
dmv magnetische beads (snel)
positieve selectie: Ab’s tegen monocyten op magnetische beads bv. CD14
nadeel: kan dat beads een effect hebben op je mole
negatieve selectie: 1e zuiveren PBMC’s, dan gebruik Ab’s tegen lymfocyten en NK cellen
=> enkel monocyten lopen door (+: geen effect v/d beads)
Inductie experiment:
Kweek de cellen (monocyten) met bepaalde celconcentratie in 24 well plaat in groeimedium
=> incuberen cellen: 37°C (humane cellen), foetaal kalfsserum (met GF),
zoutoplossing (geen osmotische shok); buffer: CO2 incubator (stabiele pH) (24-48u)
=> toevoegen verschillende stoffen => stimuleren monocyten:
TLR liganden (G+, G-, virus)/cytokinen => microbiële respons
=> Cytokine 8 (IL8) (meest gemaakt door monocyten en meest actief) vrijgezet door monocyten
=> meet hoeveelheid geïnduceerd chemokine in bovenstaande vloeistof (na centrifugatie) met
immunologische test
2. Immunologische test gebruiken voor concentratie IL-8/ CXCL8
bepalen
Concentratie IL8 bepalen
welke test?:
ELISA (meest effectief), RIA, (in cyto kijken of IL-8 productie)
western blot (moeilijk voor juiste conc. bepalen, +: je ziet ook MW van eiwit)
maak schema met verschillende stappen (zie slide 11-14)
maak lijst met nodige materiaal en reagentia
hoe bekom je de reagentia?
Reagentia nodig voor de immunologische test: Ab’s nodig
Ab’s maken:
- Polyklonale Ab maken:
w gesecreteerd door meerdere klones Ag-specifieke B cellen
Immuniseer konijn meerdere x’en met Ag
met adjuvans (alum, CFA, poly I:C => sterkere respons)
=> proefdier bloed afnemen => Ab’s uit serum zuiveren: bloed laten stollen (cellen in stolsel)
=> °zuiver serum => affiniteitschromatografie:
ofwel covalent Ag (IL8) op kolom zetten (maar is duur, wel zeer specifiek)
ofwel matrix met proteïne A of G op kopen (alle Ab’s zullen binden => crossreactie,…)
voordeel: kan meerdere keren bloed nemen van 1 muis, Ab’s tegen ≠ epitopen,
polyklonaal Ab => agglutinatie en neerslag (immunoprecipitatie)
nadeel: ≠ bloedingen => Ab’s met ≠ affiniteit, crossactiviteit tgn ander Ag
2
