1. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN: PRIMERA ETAPA
Los ác. nucleicos se encuentran en el interior de las cél.: en el núcleo (eucariotas), en el citoplasma
(procariotas) y en orgánulos como las mitocondrias o cloroplastos.
Las membranas celulares: limitan la cél. y le permiten relacionarse con el exterior. Formadas
por una bicapa lipídica y proteínas.
La pared celular: común a bacterias, levaduras, hongos y cél. vegetales. Recubre la membrana
y da rigidez y protección. Su composición varía según el tipo de organismo.
De esta forma, las membranas y paredes constituyen una barrera que se deberá vencer para tener
acceso a los ácidos nucleicos. Su análisis y manipulación por técnicas de biología molecular
comporta una etapa de purificación y extracción: con la extracción hacemos accesibles los ác.
nucleicos para usar los reactivos y enzimas necesarios, y con la purificación eliminamos
sustancias y elementos que pueden interferir en ellas.
La obtención de ácidos nucleicos purificados a partir de una muestra biológica se lleva a cabao
mediante un único protocolo técnico continuado en 3 fases:
Pretratamiento de la muestra
Extracción de ác. nucleicos
Purificación de ác. nucleicos
2. PRETRATAMEINTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
Pretratamientos específicos según la muestra para que permita obtener las suspensiones celulares,
las cuales están formadas por cél. libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno de
un medio líquido.
Pretratamientos de las muestras de biología molecular:
SANGRE: una de las muestras más habituales para estudiar los ácidos nucleicos purificándolos
a partir de uno de sus componentes celulares, los leucocitos.
Consideraciones sobre la obtención y conservación de la muestra: la muestra de sangre total
anticoagulada con EDTA o también con heparina o citrato sódico.
La extracción de los ác. nucleicos es conveniente hacerla en las 24 horas siguientes tras la
obtención, o hasta 5 días a 4ºC en la nevera, en el caso del ADN sin fragmentar (Southern Blot)
se conservará a 4ºC en la nevera duración un máximo de 3 días ya que, si pasa más tiempo, se
produce degradación y fragmentación.
Los inhibidores, para eliminación em pretratamiento del grupo hemo de la hemoglobina en PCR
lisis hematíes.
Lisis de los hematíes: válido para hematíes y muestras de médula ósea.
Lisis de los hematíes: romper los hematíes con solución o tampón de lisis
en proporción 1:3 (sangre: tampón)
o Soluciones basadas en fenómenos osmóticos: NH4Cl, KHCO3,
EDTA
o Detergentes suaves: Tris-HCl (pH 8), Tritón X-100, Sacarosa
Centrifugado de la muestra: tras la lisis de los hematíes, se centrifuga la
muestra obteniendo un sedimento o pellet y sobrenadante.
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, Eliminación del sobrenadante: eliminar la fracción líquida sobrenadante con pipeta
Pasteur, con esto se eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina
liberada por la rotura de los hematíes.
Conservación del sedimento: seguimos con el proceso de extracción de los ác. nucleicos,
en el sedimento habrán quedado los leucocitos.
Obtención de cél. mononucleadas de sangre periférica: partida para detectar, aislar y estudiar
ác. nucleicos de retrovirus que infectan linfocitos como el VIH o el HTLV.
Para esto se aíslan las cél. mononucleadas de sangre periférica o PMBC,
lo cual se consigue por centrifugación en gradiente de densidad que
requiere un medio de separación*:
Medio de separación para extracción de PMBC*: tiene una
viscosidad baja, densidad de 1,077 g/ml y una osmolaridad que
mantienen la viabilidad celular. Existen varias marcas
comerciales: Ficoll-paque ®, Histopaque ®, Lymphoprep ®…
Tiene 2 componentes:
o Ficoll: copolímero de sacarosa + epiclorhidrina (hidrofílico)
o Diatrizoato
Proceso:
Poner medio de separación en el tubo
Añadir la sangre
Centrifugar 400-800g durante 20-30 min, según el reactivo usado:
o Polisacarosa causa la agregación de hematíes facilitando su rápida sedimentación
o Granulocitos, con densidad mayor que el medio de separación, sedimentan
o Cél. mononucleadas, tienen menor densidad del medio de separación,
permanecen en interfase entre el medio y el plasma
Eliminar plasma
Aspirar capa de cél. mononucleadas usando pipeta Pasteur y transferirlo a un tubo limpio
Lavar con tampón para eliminar restos de plasma y plaquetas
Continuar con el proceso de extracción de ác. nucleicos
CULTIVOS CELULARES: para realizar estudios genómicos y expresión génica en
determinadas condiciones y bajo ciertos estímulos.
El pretratamiento consiste en al recolección de las cél., las cuales según el crecimiento del cultivo:
Cultivos en suspensión:
o Recolectar en un tubo
o Centrifugar y eliminar el medio de cultivo
o Lavar cél. con tampón o suero fisiológico antes de la extracción y purificación
de ADN y/o ARN
Cultivos en monocapa:
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, o Usar el propio frasco para continuar el proceso de extracción:
Retirar medio de cultivo
Lavar monocapa con tampón o solución salina
Extracción en el propio recipiente
o Pasar la monocapa a un tubo:
Despegar la monocapa de la pared del frasco:
Métodos mecánicos raspador
Métodos enzimáticos:
o Retirar medio de cultivo
o Lavar monocapa con tampón o solución salina
o Incubar cél. con solución de tripsina al 0,05%-0,25%
Recolectar cél. en un tubo
Lavar las cél. antes de seguir con la extracción
TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS: la obtención de ác. nucleicos a partir de
estos requiere un pretratamiento de homogeneización, lo cual es el tratamiento mecánico o
químico al que se somete un tejido para liberar las cél. que lo integran.
La cantidad de tejido depende del tipo de tejido, del método de homogeneización, del
procedimiento de extracción y del método de purificación de los ác. nucleicos.
En tejidos animales: 10mg-25mg 10µg-40µg ADN
En tejidos vegetales: 100mg-1000mg igual cantidad de ADN
Homogeneización mecánica: someter al tejido a acción trituradora o abrasiva para
desmenuzarlo.
Homogeneización mecánica automatiza: la trituración puede liberar proteasas y enzimas
que degraden componentes celulares, por ello estos procesos se hacen en frío y de forma
rápida, o añadiendo inhibidores enzimáticos. Proceso:
o Cortar el tejido en pequeños fragmentos
o Introducir en tubo o recipiente adecuado
o Se homogeneiza por la acción mecánica que proporcionan instrumentos como los
trituradores mecánicos:
Añadir agentes abrasivos (esferas de vidrio o de cerámica)
Agitar en el equipo: las esferas colisionan violentamente contra la
muestra por movimientos de oscilación o sonicación
o Una vez el tejido está homogeneizado, se transfiere (o no) a un tubo limpio para
iniciar la extracción
Homogeneización mecánica manual con mortero: minimiza el problema de la
degradación. Proceso:
o Limpiar el mortero con EtOH 70%
o Cortar el tejido en pequeños fragmentos
o Cubrir con nitrógeno líquido, ya que permite la congelación rápida del tejido
evitando la formación de cristales en el interior de las cél.
o Con la mano del mortero (previamente limpiada con EtOH 70% e introducida en
nitrógeno líquido) pulverizamos los fragmentos congelados hasta convertirlo en
polvo fino
o Dejar evaporar el nitrógeno líquido
o El polvo se transfiere a un rubo para iniciar el proceso de extracción
Homogeneización química: someter al tejido a la acción de proteasa y detergentes que
degradan los componentes tisulares disgregando las cél. Se usa para muestras pequeñas
y cortes de tejido en congelación obtenidos con criostato. Proceso:
o Se añade a la muestra la mezcla de incubación: proteasas + detergentes para la
digestión del tejido
o Se incuba la muestra a Tª elevada (37ºC-56ºC) por 12h-24h
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Los ác. nucleicos se encuentran en el interior de las cél.: en el núcleo (eucariotas), en el citoplasma
(procariotas) y en orgánulos como las mitocondrias o cloroplastos.
Las membranas celulares: limitan la cél. y le permiten relacionarse con el exterior. Formadas
por una bicapa lipídica y proteínas.
La pared celular: común a bacterias, levaduras, hongos y cél. vegetales. Recubre la membrana
y da rigidez y protección. Su composición varía según el tipo de organismo.
De esta forma, las membranas y paredes constituyen una barrera que se deberá vencer para tener
acceso a los ácidos nucleicos. Su análisis y manipulación por técnicas de biología molecular
comporta una etapa de purificación y extracción: con la extracción hacemos accesibles los ác.
nucleicos para usar los reactivos y enzimas necesarios, y con la purificación eliminamos
sustancias y elementos que pueden interferir en ellas.
La obtención de ácidos nucleicos purificados a partir de una muestra biológica se lleva a cabao
mediante un único protocolo técnico continuado en 3 fases:
Pretratamiento de la muestra
Extracción de ác. nucleicos
Purificación de ác. nucleicos
2. PRETRATAMEINTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
Pretratamientos específicos según la muestra para que permita obtener las suspensiones celulares,
las cuales están formadas por cél. libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno de
un medio líquido.
Pretratamientos de las muestras de biología molecular:
SANGRE: una de las muestras más habituales para estudiar los ácidos nucleicos purificándolos
a partir de uno de sus componentes celulares, los leucocitos.
Consideraciones sobre la obtención y conservación de la muestra: la muestra de sangre total
anticoagulada con EDTA o también con heparina o citrato sódico.
La extracción de los ác. nucleicos es conveniente hacerla en las 24 horas siguientes tras la
obtención, o hasta 5 días a 4ºC en la nevera, en el caso del ADN sin fragmentar (Southern Blot)
se conservará a 4ºC en la nevera duración un máximo de 3 días ya que, si pasa más tiempo, se
produce degradación y fragmentación.
Los inhibidores, para eliminación em pretratamiento del grupo hemo de la hemoglobina en PCR
lisis hematíes.
Lisis de los hematíes: válido para hematíes y muestras de médula ósea.
Lisis de los hematíes: romper los hematíes con solución o tampón de lisis
en proporción 1:3 (sangre: tampón)
o Soluciones basadas en fenómenos osmóticos: NH4Cl, KHCO3,
EDTA
o Detergentes suaves: Tris-HCl (pH 8), Tritón X-100, Sacarosa
Centrifugado de la muestra: tras la lisis de los hematíes, se centrifuga la
muestra obteniendo un sedimento o pellet y sobrenadante.
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, Eliminación del sobrenadante: eliminar la fracción líquida sobrenadante con pipeta
Pasteur, con esto se eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina
liberada por la rotura de los hematíes.
Conservación del sedimento: seguimos con el proceso de extracción de los ác. nucleicos,
en el sedimento habrán quedado los leucocitos.
Obtención de cél. mononucleadas de sangre periférica: partida para detectar, aislar y estudiar
ác. nucleicos de retrovirus que infectan linfocitos como el VIH o el HTLV.
Para esto se aíslan las cél. mononucleadas de sangre periférica o PMBC,
lo cual se consigue por centrifugación en gradiente de densidad que
requiere un medio de separación*:
Medio de separación para extracción de PMBC*: tiene una
viscosidad baja, densidad de 1,077 g/ml y una osmolaridad que
mantienen la viabilidad celular. Existen varias marcas
comerciales: Ficoll-paque ®, Histopaque ®, Lymphoprep ®…
Tiene 2 componentes:
o Ficoll: copolímero de sacarosa + epiclorhidrina (hidrofílico)
o Diatrizoato
Proceso:
Poner medio de separación en el tubo
Añadir la sangre
Centrifugar 400-800g durante 20-30 min, según el reactivo usado:
o Polisacarosa causa la agregación de hematíes facilitando su rápida sedimentación
o Granulocitos, con densidad mayor que el medio de separación, sedimentan
o Cél. mononucleadas, tienen menor densidad del medio de separación,
permanecen en interfase entre el medio y el plasma
Eliminar plasma
Aspirar capa de cél. mononucleadas usando pipeta Pasteur y transferirlo a un tubo limpio
Lavar con tampón para eliminar restos de plasma y plaquetas
Continuar con el proceso de extracción de ác. nucleicos
CULTIVOS CELULARES: para realizar estudios genómicos y expresión génica en
determinadas condiciones y bajo ciertos estímulos.
El pretratamiento consiste en al recolección de las cél., las cuales según el crecimiento del cultivo:
Cultivos en suspensión:
o Recolectar en un tubo
o Centrifugar y eliminar el medio de cultivo
o Lavar cél. con tampón o suero fisiológico antes de la extracción y purificación
de ADN y/o ARN
Cultivos en monocapa:
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, o Usar el propio frasco para continuar el proceso de extracción:
Retirar medio de cultivo
Lavar monocapa con tampón o solución salina
Extracción en el propio recipiente
o Pasar la monocapa a un tubo:
Despegar la monocapa de la pared del frasco:
Métodos mecánicos raspador
Métodos enzimáticos:
o Retirar medio de cultivo
o Lavar monocapa con tampón o solución salina
o Incubar cél. con solución de tripsina al 0,05%-0,25%
Recolectar cél. en un tubo
Lavar las cél. antes de seguir con la extracción
TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS: la obtención de ác. nucleicos a partir de
estos requiere un pretratamiento de homogeneización, lo cual es el tratamiento mecánico o
químico al que se somete un tejido para liberar las cél. que lo integran.
La cantidad de tejido depende del tipo de tejido, del método de homogeneización, del
procedimiento de extracción y del método de purificación de los ác. nucleicos.
En tejidos animales: 10mg-25mg 10µg-40µg ADN
En tejidos vegetales: 100mg-1000mg igual cantidad de ADN
Homogeneización mecánica: someter al tejido a acción trituradora o abrasiva para
desmenuzarlo.
Homogeneización mecánica automatiza: la trituración puede liberar proteasas y enzimas
que degraden componentes celulares, por ello estos procesos se hacen en frío y de forma
rápida, o añadiendo inhibidores enzimáticos. Proceso:
o Cortar el tejido en pequeños fragmentos
o Introducir en tubo o recipiente adecuado
o Se homogeneiza por la acción mecánica que proporcionan instrumentos como los
trituradores mecánicos:
Añadir agentes abrasivos (esferas de vidrio o de cerámica)
Agitar en el equipo: las esferas colisionan violentamente contra la
muestra por movimientos de oscilación o sonicación
o Una vez el tejido está homogeneizado, se transfiere (o no) a un tubo limpio para
iniciar la extracción
Homogeneización mecánica manual con mortero: minimiza el problema de la
degradación. Proceso:
o Limpiar el mortero con EtOH 70%
o Cortar el tejido en pequeños fragmentos
o Cubrir con nitrógeno líquido, ya que permite la congelación rápida del tejido
evitando la formación de cristales en el interior de las cél.
o Con la mano del mortero (previamente limpiada con EtOH 70% e introducida en
nitrógeno líquido) pulverizamos los fragmentos congelados hasta convertirlo en
polvo fino
o Dejar evaporar el nitrógeno líquido
o El polvo se transfiere a un rubo para iniciar el proceso de extracción
Homogeneización química: someter al tejido a la acción de proteasa y detergentes que
degradan los componentes tisulares disgregando las cél. Se usa para muestras pequeñas
y cortes de tejido en congelación obtenidos con criostato. Proceso:
o Se añade a la muestra la mezcla de incubación: proteasas + detergentes para la
digestión del tejido
o Se incuba la muestra a Tª elevada (37ºC-56ºC) por 12h-24h
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